Ce protocole utilise l’irradiation en lumière violette visible pour induire la photolyse des flavines mononucléotidiques. Cela produit une grande quantité de radicaux libres, qui inhibent les bactéries pathogènes telles que Staphylococcus aureus et E. coli. Nous avons testé le mononucléotide flavine comme photosensibilisant approprié.
Dans ce protocole, nous utilisons une lumière violette visible qui est sûre et ne nécessite pas d’équipement coûteux. Cette méthode peut être utilisée pour le traitement de la peau lésée ou des tissus sous-cutanés infectés en insérant une fibre optique pour l’éclairage. Il peut également être appliqué à la pratique de l’assainissement dans l’industrie alimentaire.
Tang-Yu Chen, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure Pour commencer, montez six diodes électroluminescentes de 12 volts chacune à l’intérieur d’un gobelet en plastique opaque. Prenez un tube à essai en verre d’un diamètre de 13 millimètres et d’une hauteur de 100 millimètres et ajoutez les réactifs au tube. Fixez les tubes en haut de la tasse et placez cette installation à une température constante de 25 trois degrés Celsius.
Surveiller et enregistrer la température des unités d’essai tout au long des réactions photolytiques à l’aide d’un thermomètre infrarouge. Ensuite, préparez une solution FMN de 0,1 millimolaire dans un tampon de phosphate de potassium de 100 millimolaires à pH 7,8. Exposez trois millilitres d’échantillons FMN à la lumière bleue, verte, rouge ou violette pendant cinq minutes.
En parallèle, gardez trois millilitres de solution FMN dans l’obscurité comme contrôle. Placez l’échantillon dans un spectrophotomètre UV-visible et enregistrez l’absorbance des échantillons irradiés dans la plage de 250 à 750 nanomètres. Pour préparer la détection des radicaux superoxydes, ajoutez d’abord 109,3 milligrammes de L-méthionine à 73,3 millilitres de tampon phosphate 100 millimolaires à pH 7,8.
Dans la solution, ajoutez 10 milligrammes de poudre NBT et 1,5 millilitre de FMN 0,117 millimolaire. Exposez un millilitre de la solution réactionnelle à la lumière LED bleue ou violette pendant une à cinq minutes. Enregistrer l’absorbance de 516 nanomètres pour détecter le formazan, qui est produit par la réaction photochimique de NBT.
Inoculer une colonie de Staphylococcus aureus dans 10 millilitres de bouillon de lysogénie dans un tube à essai à bouchon vissé de 15 millilitres. Cultivez la culture à 37 degrés Celsius pendant 16 heures dans un shaker. Transférer 0,5 millilitre de la culture dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre.
Diluer la culture à une densité optique de 0,5 à 600 nanomètres en ajoutant de l’eau stérilisée. Ensuite, transférez 0,5 millilitre de la culture dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Centrifuger à 14 000 g pendant 10 minutes et décanter le surnageant.
Ajouter un millilitre de solution tamponnée FMN à la pastille cellulaire et au vortex. Pour le contrôle irradié, ajouter un millilitre de tampon phosphate. Transférer un millilitre de solution cellulaire bactérienne contenant 30 micromolaires de FMN et un tampon phosphate dans des tubes en verre.
Placez-les pour un rayonnement sous lumière violette à 10 watts par mètre carré pendant 30 minutes. Ensuite, transférez un millilitre de solution cellulaire bactérienne contenant 30-60 et 120 micromolaires FMN et tampon phosphate dans des tubes en verre. Irradier avec de la lumière bleue pendant 120 minutes à 20 watts par mètre carré.
De plus, irradiez un tube contenant un millilitre de FMN 120 micromolaires pendant 60 minutes. Après irradiation, ajouter 0,2 millilitre de la solution réactionnelle sur une plaque de gélose luria. Étaler la solution à l’aide d’une tige de verre en forme de L et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, calculez la numération sur plaque viable et le taux d’inactivation de Staphylococcus aureus. Préparer les échantillons de staphylocoque doré comme décrit précédemment pour obtenir une pastille cellulaire. À 75 millilitres de tampon phosphate, ajoutez 0,1093 gramme de L-méthionine, 0,1 gramme de NBT et 25 millilitres de solution FMN.
Ajouter un millilitre de chaque solution réactive avec des concentrations variables de FMN aux pastilles cellulaires et au vortex. Irradier les solutions sous lumière violette à 10 watts par mètre carré pendant 10 minutes. Centrifuger le mélange à 14 000 G pendant 10 minutes et décanter le surnageant.
Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de diméthylsulfoxyde pour extraire le NBT réduit. Enregistrez l’absorbance à 560 nanomètres. L’irradiation du FMN avec lumière verte et rouge n’a montré aucun effet sur les pics à 372 et 444 nanomètres par rapport au contrôle de l’obscurité, tandis que la réduction de l’absorbance du FMN à 444 nanomètres a été observée sous lumière bleue et violette, indiquant une photolyse accrue.
La détection des radicaux superoxydes formés lors de la photolyse FMN sous lumière bleue ou violette a été effectuée à l’aide de la réduction NBT. L’effet photochimique du FMN dépendait du temps d’irradiation. La photolyse FMN par irradiation à la lumière bleue ou violette a entraîné une inactivation significative de Staphylococcus aureus.
Une inactivation dose-dépendante a été observée pour l’irradiation en lumière bleue, avec une inactivation de 97 % pour le FMN 120 micromolaires. Sous lumière violette, un taux d’inactivation de 96% a été atteint pour Staphylococcus aureus, avec 30-micromolaire FMN montrant une efficacité plus élevée pour l’inactivation bactérienne. La réduction de la NBT a montré que l’effet photolytique de la FMN sous lumière violette chez Staphylococcus aureus était proportionnel à la concentration de FMN.
Dans des conditions non traitées, une abondance plus faible de radicaux superoxydes a été indiquée par une faible absorbance à 560 nanomètres, tandis que des valeurs d’absorbance plus élevées dans le traitement FMN ont montré une production abondante de radicaux superoxydes, entraînant une augmentation de l’effet photochimique. Il est essentiel d’avoir une bonne source de lumière LED. La largeur spectrale du régime de lumière violette doit être étroite pour éviter tout chevauchement avec l’absorption des UV, car le rayonnement UV peut être dangereux.
Après la procédure, d’autres composés chimiques tels que la tétracycline, la doxycycline, la catéchine, et peuvent être testés pour la photolyse similaire à FMN.
