이 프로토콜은 가시광선 조사를 사용하여 플라빈 모노뉴클레오티드 광분해를 유도합니다. 이것은 황색 포도상 구균 및 대장균과 같은 병원성 박테리아를 억제하는 다량의 자유 라디칼을 생성합니다. 우리는 적절한 감광제로서 플라빈 모노뉴클레오티드를 테스트했습니다.
이 프로토콜에서는 안전하고 값 비싼 장비가 필요하지 않은 가시 광선을 사용합니다. 이 방법은 조명용 광섬유를 삽입하여 손상된 피부 또는 감염된 피하 조직의 치료에 사용할 수 있습니다. 또한 식품 산업의 위생 관행에도 적용 할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생 인 Tang-Yu Chen이 될 것입니다. 시작하려면 불투명 한 플라스틱 컵 내부에 각각 12 볼트의 발광 다이오드 6 개를 장착하십시오. 직경 13mm, 높이 100mm의 유리 시험관을 가져다가 반응물을 튜브에 첨가하십시오. 컵 상단에 튜브를 고정하고 이 설정을 섭씨 25도 3도의 일정한 온도에 놓습니다.
적외선 온도계로 광분해 반응 전반에 걸쳐 테스트 장치의 온도를 모니터링하고 기록합니다. 다음으로, pH 7.8에서 100 밀리몰 인산 칼륨 완충액에 0.1 밀리몰 FMN 용액을 준비한다. 3밀리리터의 FMN 샘플을 각각 파란색, 녹색, 빨간색 또는 보라색 빛에 5분 동안 노출시킵니다.
병렬로, 3 밀리리터의 FMN 용액을 어둠 속에 대조군으로 보관하십시오. 샘플을 UV 가시 분광 광도계에 넣고 250-750 나노 미터 범위에서 조사 된 샘플의 흡광도를 기록합니다. 슈퍼 옥사이드 라디칼의 검출을 준비하려면 먼저 pH 7.8에서 100 밀리몰 인산염 완충액 73.3 밀리리터에 109.3 밀리그램의 L- 메티오닌을 첨가하십시오.
용액에 NBT 분말 10 밀리그램과 0.117 밀리몰 FMN 1.5 밀리리터를 첨가한다. 반응 용액 1 밀리리터를 청색 또는 보라색 LED 빛에 1-5 분 동안 노출시킵니다. NBT의 광화학 반응에 의해 생성되는 포르마잔을 검출하기 위해 516나노미터의 흡광도를 기록합니다.
황색포도상구균의 콜로니를 15밀리리터의 나사로 덮인 시험관에 10밀리리터의 리소제닉 액체에 접종합니다. 셰이커에서 섭씨 37도에서 16 시간 동안 배양 물을 재배하십시오. 0.5 밀리리터의 배양 물을 1.5 밀리리터의 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
배양물을 멸균된 물을 첨가하여 600 나노미터에서 0.5의 광학 밀도로 희석한다. 그런 다음 0.5 밀리리터의 배양 물을 1.5 밀리리터의 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 14, 000 G에서 10 분 동안 원심 분리하고 상청액을 따라 내십시오.
1 밀리리터의 FMN 완충 용액을 세포 펠릿과 와류에 첨가하십시오. 조사 제어를 위해 1 밀리리터의 인산염 완충액을 추가하십시오. 30 마이크로 몰 FMN과 인산염 완충액을 함유 한 박테리아 세포 용액 1 밀리리터를 유리관으로 옮깁니다.
30 분 동안 미터 평방 당 10 와트의 보라색 빛 아래에서 방사선을 위해 두십시오. 그런 다음 30-60 및 120 마이크로 몰 FMN과 인산염 완충액을 포함하는 박테리아 세포 용액 1 밀리리터를 유리관에 옮깁니다. 평방 미터당 20와트로 120분 동안 청색광을 조사합니다.
또한 120 마이크로 몰 FMN 1 밀리리터가 들어있는 튜브를 60 분 동안 조사하십시오. 조사 후, 0.2 밀리리터의 반응 용액을 루리아 한천 플레이트에 첨가한다. L 자형 유리 막대를 사용하여 용액을 펴고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.
다음날, 황색 포도상 구균의 생존 가능한 플레이트 수와 비활성화 비율을 계산하십시오. 앞서 설명한 바와 같이 황색포도상구균 샘플을 준비하여 세포 펠렛을 얻었다. 75 밀리리터의 인산염 완충액에 0.1093 그램의 L- 메티오닌, 0.1 그램의 NBT 및 25 밀리리터의 FMN 용액을 첨가하십시오.
다양한 FMN 농도의 각 반응 용액 1 밀리리터를 세포 펠릿과 와류에 첨가하십시오. 보라색 빛 아래에서 미터 평방 당 10 와트로 10 분 동안 용액을 조사하십시오. 혼합물을 14, 000 G에서 10 분 동안 원심 분리하고 상청액을 따라 내린다.
감소된 NBT를 추출하기 위해 1밀리리터의 디메틸 설폭사이드에 펠릿을 재현탁합니다. 560 나노미터에서 흡광도를 기록합니다. 녹색 및 적색광으로 FMN을 조사하면 어두운 대조군에 비해 372 및 444 나노 미터의 피크에 영향을 미치지 않는 반면, 444 나노 미터에서 FMN의 흡광도 감소는 청색 및 보라색 빛에서 관찰되어 증가 된 광분해를 나타냅니다.
청색광 또는 보라색 빛 하에서 FMN 광분해 동안 형성된 슈퍼 옥사이드 라디칼의 검출은 NBT 감소를 사용하여 수행되었습니다. FMN의 광화학적 효과는 조사 시간에 의존적이었다. 청색광 또는 보라색 광 조사를 사용한 FMN 광분해는 황색 포도상 구균의 현저한 불 활성화를 초래했습니다.
청색광 조사에서 용량 의존적 불활성화가 관찰되었으며, 120-마이크로몰 FMN에 대해 97%불활성화가 달성되었습니다. 보라색 빛 아래에서 황색포도상구균에 대해 96%의 불활성화율이 달성되었으며 30마이크로몰 FMN은 박테리아 불활성화에 대해 더 높은 효능을 보였습니다. NBT 감소는 황색포도상구균의 보라색 빛 하에서 FMN의 광분해 효과가 FMN 농도에 비례한다는 것을 보여주었습니다.
처리되지 않은 조건에서, 슈퍼 옥사이드 라디칼의 낮은 존재는 560 나노 미터에서 낮은 흡광도로 나타 났으며, FMN 처리에서 더 높은 흡광도 값은 슈퍼 옥사이드 라디칼의 풍부한 생성을 보여 광화학적 효과를 증가시켰다. 좋은 LED 광원을 갖는 것이 중요합니다. 자외선은 위험할 수 있으므로 자외선 흡수와 겹치지 않도록 보라색 광 영역의 스펙트럼 폭이 좁아야 합니다.
절차에 따라 테트라사이클린, 독시사이클린, 카테킨과 같은 다른 화합물이 FMN과 유사한 광분해에 대해 시험될 수 있습니다.
