Bu protokol, flavin mononükleotid fotolizini indüklemek için görünür mor ışık ışınlaması kullanır. Bu, Staphylococcus aureus ve E.coli gibi patojenik bakterileri inhibe eden çok miktarda serbest radikal üretir. Flavin mononükleotidi uygun bir fotosensitizör olarak test ettik.
Bu protokolde, güvenli ve pahalı ekipman gerektirmeyen görünür mor ışık kullanıyoruz. Bu yöntem, aydınlatma için bir optik fiber yerleştirilerek yaralı cildin veya enfekte olmuş deri altı dokularının tedavisinde kullanılabilir. Gıda endüstrisindeki sanitasyon uygulamasına da uygulanabilir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Tang-Yu Chen olacak Başlamak için, opak bir plastik kabın içine her biri 12 voltluk altı ışık yayan diyot monte edin. 13 milimetre çapında ve 100 milimetre yüksekliğinde bir cam test tüpü alın ve reaktanları tüpe ekleyin. Tüpleri kabın üstüne sabitleyin ve bu kurulumu 25 üç santigrat derece sabit bir sıcaklığa yerleştirin.
Fotolitik reaksiyonlar boyunca test ünitelerinin sıcaklığını kızılötesi termometre ile izleyin ve kaydedin. Daha sonra, pH 7.8'de 100 milimolar potasyum fosfat tamponunda 0.1 milimolar FMN çözeltisi hazırlayın. Her biri üç mililitre FMN örneğini beş dakika boyunca mavi, yeşil, kırmızı veya mor ışığa maruz bırakın.
Paralel olarak, kontrol olarak karanlıkta üç mililitre FMN çözeltisi bulundurun. Numuneyi UV tarafından görülebilen bir spektrofotometreye yerleştirin ve ışınlanmış numunelerin emilimini 250 ila 750 nanometre aralığında kaydedin. Süperoksit radikallerinin tespitine hazırlanmak için, önce pH 7.8'de 73.3 mililitre 100 milimolar fosfat tamponuna 109.3 miligram L-metiyonin ekleyin.
Çözeltiye 10 miligram NBT tozu ve 1.5 mililitre 0.117 milimolar FMN ekleyin. Reaksiyon çözeltisinin bir mililitresini bir ila beş dakika boyunca mavi veya mor LED ışığa maruz bırakın. NBT'nin fotokimyasal reaksiyonu tarafından üretilen formazan'ı tespit etmek için 516 nanometrenin emiciliğini kaydedin.
Bir Staphylococcus aureus kolonisini, 15 mililitrelik vidalı kapaklı bir test tüpünde 10 mililitre lizojen et suyuna aşılayın. Kültürü bir çalkalayıcıda 16 saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Kültürün 0,5 mililitresini 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Sterilize su ekleyerek kültürü 600 nanometrede 0,5 optik yoğunluğa kadar seyreltin. Daha sonra, kültürün 0,5 mililitresini 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. 10 dakika boyunca 14.000 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı boşaltın.
Hücre peletine ve girdabına bir mililitre FMN tamponlu çözelti ekleyin. Işınlanmış kontrol için, bir mililitre fosfat tamponu ekleyin. 30 mikromolar FMN ve fosfat tamponu içeren bir mililitre bakteri hücresi çözeltisini cam tüplere aktarın.
Onları 30 dakika boyunca metrekare başına 10 watt'ta mor ışık altında bir radyasyon için yerleştirin. Daha sonra, cam tüplerde 30-60 ve 120 mikromolar FMN ve fosfat tamponu içeren bir mililitre bakteri hücresi çözeltisi aktarın. Metrekare başına 20 watt'ta 120 dakika boyunca mavi ışıkla ışınlayın.
Ayrıca, 60 dakika boyunca bir mililitre 120 mikromolar FMN içeren bir tüpü ışınlayın. Işınlamadan sonra, bir luria agar plakasına 0.2 mililitre reaksiyon çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi L şeklinde bir cam çubuk kullanarak yayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, Staphylococcus aureus'un canlı plaka sayısını ve inaktivasyon oranını hesaplayın. Bir hücre peleti elde etmek için staphylococcus aureus örneklerini daha önce açıklandığı gibi hazırlayın. 75 mililitre fosfat tamponuna 0.1093 gram L-metiyonin, 0.1 gram NBT ve 25 mililitre FMN çözeltisi ekleyin.
Hücre peletlerine ve vortekse değişen FMN konsantrasyonlarına sahip her bir reaktant çözeltisinden bir mililitre ekleyin. Çözeltileri mor ışık altında 10 dakika boyunca metre kare başına 10 watt'ta ışınlayın. Karışımı 10 dakika boyunca 14.000 G'de santrifüj edin ve süpernatanı boşaltın.
İndirgenmiş NBT'yi çıkarmak için peleti bir mililitre dimetil sülfoksit içinde yeniden askıya alın. Absorbansı 560 nanometrede kaydedin. FMN'nin yeşil ve kırmızı ışıkla ışınlanması, karanlık kontrole kıyasla 372 ve 444 nanometredeki zirveler üzerinde hiçbir etki göstermezken, FMN'nin 444 nanometrede emilimindeki azalma, mavi ve mor ışık altında gözlendi ve bu da fotolizin arttığını gösterdi.
FMN fotolizi sırasında mavi veya mor ışık altında oluşan süperoksit radikallerinin tespiti NBT indirgemesi kullanılarak yapıldı. FMN'nin fotokimyasal etkisi ışınlama süresine bağlıydı. Mavi veya mor ışık ışınlaması kullanılarak yapılan FMN fotolizi, Staphylococcus aureus'un önemli ölçüde inaktivasyonu ile sonuçlandı.
Mavi ışık ışınlaması için doza bağımlı inaktivasyon gözlendi ve 120-mikromolar FMN için% 97 inaktivasyon elde edildi. Mor ışık altında, staphylococcus aureus için% 96'lık bir inaktivasyon oranı elde edildi, 30-mikromolar FMN bakteriyel inaktivasyon için daha yüksek etkinlik gösterdi. NBT azalması, Staphylococcus aureus'ta mor ışık altında FMN'nin fotolitik etkisinin FMN konsantrasyonu ile orantılı olduğunu göstermiştir.
İşlenmemiş koşullarda, 560 nanometrede düşük absorbans ile daha düşük bir süperoksit radikali bolluğu belirtilirken, FMN muamelesindeki daha yüksek absorbans değerleri, bol miktarda süperoksit radikali üretimi gösterdi ve bu da fotokimyasal etkinin artmasına neden oldu. İyi bir LED ışık kaynağına sahip olmak çok önemlidir. Mor ışık rejiminin spektral genişliği, UV radyasyonu tehlikeli olabileceğinden, UV emilimi ile herhangi bir örtüşmeyi önlemek için dar olmalıdır.
İşlemi takiben, tetrasiklin, doksisiklin, kateşin gibi diğer kimyasal bileşikler ve FMN'ye benzer fotoliz için test edilebilir.
