زرع الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان في دماغ الفئران المناعية عبر طريق الأنف غير الغازي

يسمح هذا البروتوكول بزرع iPSMG بشكل غير جراحي في دماغ الفأر المناعي من خلال الجمع بين تشغيل / إيقاف الدوائية لمضاد مستقبلات CSF1 PLX5622 مع الزرع عبر الأنف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن زرع iPSMG دون التسبب في تلف الدماغ حتى في الفئران ذات الكفاءة المناعية. قد تكون زراعة الخلايا الدبقية الدقيقة بمثابة علاج محتمل لتبادل الخلايا الدبقية الصغيرة المختلة وظيفيا مع تلك الوظيفية في مختلف الأمراض العصبية التنكسية في المستقبل.

سيوضح الإجراء بيجاي باراجولي ، وهو باحث من مختبري. ابدأ بسرعة بإذابة الخلايا الدبقية البشرية المستحثة متعددة القدرات المجمدة المستمدة من الخلايا الجذعية في حمام مائي بزاوية 37 درجة مئوية. قم بتدوير العينات حتى يذوب الجليد المرئي.

أضف iPSMG المذاب إلى وسائط الثقافة ، التي تم تسخينها إلى 37 درجة مئوية. أضف ملليلتر واحد من الخلايا إلى 10 ملليلتر من وسائط الثقافة. الطرد المركزي للخلايا في 300 مرة غرام لمدة خمس دقائق للحصول على بيليه الخلية.

إزالة supernatant دون إزعاج بيليه الخلية. أضف وسط الزرع للحصول على تركيز خلية من 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ميكرولتر. ضع iPSMG على الجليد ، وانتقل على الفور إلى الزرع.

لإعداد الفئران لزرع الأنف ، قم بإطعام الفئران الذكور بنظام غذائي يحتوي على PLX لمدة سبعة أيام. في نهاية اليوم السابع ، توقف عن اتباع نظام PLX الغذائي وأطعم الفئران بنظام غذائي طبيعي. قبل ساعة واحدة من زرع iPSMG عبر الأنف ، قم بإعطاء 2.5 ميكرولتر من الهيالورونيداز في PBS لكل فتحة أنف مرتين باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر لزيادة نفاذية الغشاء المخاطي للأنف.

ضع الفئران في وضع ضعيف بعد تطبيق الهيالورونيداز. إدارة 2.5 ميكرولتر من الهيالورونيداز قبل عشر دقائق من زرع iPSMG عبر الأنف. ضع 2.5 ميكرولتر من تعليق الخلية في فتحة أنف واحدة من الماوس باستخدام طرف ماصة سعة 10 ميكرولترات.

ضع الماوس في وضع ضعيف لمدة خمس دقائق قبل إعطاء تعليق الخلية إلى فتحة الأنف الأخرى. إدارة تعليق الخلية أربع مرات ، وتطبيق حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر لكل. بعد 48 ساعة من توقف تغذية PLX ، كرر إعطاء الهيالورونيداز وتعليق الخلايا على نفس الفئران.

لإدارة السيتوكينات ، ضع 2.5 ميكرولتر من وسط الزرع في فتحة أنف واحدة من الماوس باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر. بعد شهرين من الزرع عبر الأنف ، يمكن تحديد عدد الخلايا المزروعة عن طريق حساب الخلايا الإيجابية لكل من العلامات الخاصة بالإنسان والعلامات الدبقية الصغيرة. الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران الذاتية المنشأ إيجابية لعلامة عموم الخلايا الدبقية الصغيرة فقط.

في الفئران الضابطة ، تم اكتشاف الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران فقط في كل من القشرة والحصين. في قشرة الفئران المزروعة iPSMG ، تم اكتشاف الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران فقط ، بينما تم اكتشاف iPSMG في الحصين. عند محاولة هذا البروتوكول ، تعد الإزالة الكاملة لل supernatant ضرورية لمنع تخفيف السيتوكينات.

من الأهمية بمكان تطبيق السيتوكين كل 12 ساعة من أجل بقاء الخلايا المزروعة. مطلوب استنفاد الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران الذاتية المنشأ لزرع iPSMG. يسمح هذا الإجراء بزرع iPSMG في دماغ فأر طبيعي أو مريض.

وبالتالي ، يمكن تحديد خصائص iPSMG وكذلك الاستجابة للمرض. هذه التقنية مناسبة لتحديد الخاصية في الجسم الحي ل iPSMG في دماغ الماوس. وبالتالي ، فإن زرع iPSMG في الفئران النموذجية للمرض سيساعدنا على فهم الاستجابة وقد يمهد الطريق لهدف علاجي جديد.