이 프로토콜은 CSF1 수용체 길항제 PLX5622의 약리학적 온/오프를 경비강 이식과 결합하여 면역적격 마우스 뇌에 iPSMG의 비침습적 이식을 허용한다. 이 기술의 가장 큰 장점은 iPSMG가 면역 적격 마우스에서도 뇌 손상을 유발하지 않고 이식 될 수 있다는 것입니다. 미세아교세포 이식은 장래에 다양한 신경퇴행성 질환에서 기능성 미세아교세포와 기능성 미세아교세포를 교환하기 위한 잠재적인 치료법으로 작용할 수 있다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구원 인 Bijay Parajuli가 될 것입니다. 먼저 동결유도만능줄기세포 유래 인간 미세아교세포를 섭씨 37도 수조에서 빠르게 해동시킨다. 보이는 모든 얼음이 녹을 때까지 샘플을 소용돌이치십시오.
해동된 iPSMG를 배양 배지에 첨가하고, 섭씨 37도까지 가온한다. 10 밀리리터의 배양 배지에 1 밀리리터의 세포를 첨가하십시오. 세포를 5분 동안 300회 g에서 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었다.
세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거한다. 이식 배지를 첨가하여 마이크로리터 당 다섯 번째 세포 농도 10 내지 10을 얻었다. iPSMG를 얼음 위에 놓고 즉시 이식을 진행하십시오.
경비강 이식을 위한 마우스를 준비하려면, 수컷 마우스에게 칠일 동안 PLX를 함유한 식단을 먹이십시오. 일곱째 날이 끝나면 PLX 식단을 중단하고 쥐에게 정상적인 식단을 먹이십시오. iPSMG의 경비강 이식 1시간 전에, PBS에 2.5 마이크로리터의 히알루로니다아제를 10-마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 콧구멍에 두 번 투여하여 비강 점막에 대한 투과성을 증가시킨다.
마우스를 히알루로니다아제 적용 후 수핀 위치에 놓는다. iPSMG의 경비강 이식 10분 전에 히알루로니다아제 2.5 마이크로리터를 투여한다. 10 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 마우스의 한 콧구멍에 2.5 마이크로리터의 세포 현탁액을 바릅니다.
세포 현탁액을 다른 콧구멍에 투여하기 전에 마우스를 다섯 분 동안 수핀 위치에 놓는다. 세포 현탁액을 네 번 투여하고 동물 당 20 마이크로 리터의 총 부피를 적용하십시오. PLX 공급의 중단 48시간 후, 동일한 마우스에 히알루로니다제 및 세포 현탁액의 투여를 반복한다.
사이토카인을 투여하려면 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 2.5 마이크로리터의 이식 배지를 마우스의 한 콧구멍에 도포한다. 두 달간의 경비강 이식 후, 이식된 세포의 수는 인간 특이적 및 범-미세아교세포 마커 둘 다에 대해 양성인 세포를 계수함으로써 결정될 수 있다. 내인성 마우스 미세아교세포는 범-미세아교세포 마커에 대해서만 양성이다.
대조군 마우스에서, 단지 마우스 미세아교세포만이 피질과 해마 둘 다에서 검출되었다. iPSMG 이식 마우스의 피질에서는 마우스 미세아교세포만 검출된 반면, 해마에서는 iPSMG가 검출되었다. 이 프로토콜을 시도 할 때, 상청액의 완전한 제거는 사이토 카인의 희석을 방지하기 위해 필수적입니다.
이식 된 세포의 생존력을 위해 12 시간마다 사이토 카인을 적용하는 것이 중요합니다. 내인성 마우스 미세아교세포의 고갈은 iPSMG의 이식에 필요하다. 이 절차는 정상 또는 병든 마우스 뇌에 iPSMG의 이식을 허용합니다.
따라서, iPSMG의 특성뿐만 아니라 질병에 대한 반응이 결정될 수 있다. 이 기술은 마우스 뇌에서 iPSMG의 생체내 특성을 결정하는데 적합하다. 따라서, iPSMG를 질병 모델 마우스에 이식하는 것은 우리가 반응을 이해하는 데 도움이 될 것이며 새로운 치료 표적을위한 길을 닦을 수 있습니다.
