Este protocolo permite um transplante não invasivo de iPSMG no cérebro de camundongos imunocompetente, combinando on/off farmacológico de um antagonista receptor CSF1 PLX5622 com transplante transnasal. A principal vantagem dessa técnica é que o iPSMG pode ser transplantado sem induzir danos cerebrais mesmo em camundongos imunocompetuntes. O transplante microglial pode servir como uma terapia potencial para trocar microglia disfuncional com as funcionais em várias doenças neurodegenerativas no futuro.
Demonstrando o procedimento estará Bijay Parajuli, pesquisador do meu laboratório. Comece descongelando rapidamente as células de microglia humanas derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas em um banho de água Celsius de 37 graus. Gire as amostras até que todo o gelo visível tenha derretido.
Adicione o iPSMG descongelado aos meios de cultura, aquecido a 37 graus Celsius. Adicione um mililitro de células a 10 mililitros de mídia cultural. Centrifugar as células a 300 vezes g durante cinco minutos para obter uma pelota celular.
Remova o supernatante sem perturbar a pelota celular. Adicione o meio de transplante para obter uma concentração celular de 10 a cinco células por microliter. Coloque o iPSMG no gelo e proceda imediatamente para o transplante.
Para preparar camundongos para transplante transnasal, alimente os camundongos machos com uma dieta contendo PLX por sete dias. No final do sétimo dia, cesse a dieta PLX e alimente os camundongos com uma dieta normal. Uma hora antes do transplante transnasal do iPSMG, administre 2,5 microlitros de hialuronidase na PBS para cada narina duas vezes usando uma ponta de pipeta de 10 microliteres para aumentar a permeabilidade à mucosa nasal.
Coloque os ratos na posição supina após a aplicação de hialuronidase. Administrar 2,5 microlitros de hialuronidase dez minutos antes do transplante transnasal do iPSMG. Aplique 2,5 microliters de suspensão celular em uma narina do mouse usando uma ponta de pipeta de 10 microliteres.
Coloque o mouse na posição supina por cinco minutos antes da administração da suspensão da célula para a outra narina. Administre a suspensão celular quatro vezes, aplicando um volume total de 20 microliters por animal. 48 horas após a cessação da alimentação PLX, repita a administração de hialuronidase e suspensão celular nos mesmos camundongos.
Para a administração de citocinas, aplique 2,5 microlitradores do meio de transplante em uma narina do mouse usando uma ponta de pipeta de 10 microliteres. Após dois meses de transplante transnasal, o número de células transplantadas pode ser determinado contando células positivas tanto para marcadores humanos quanto pan-microgliais. Microglia de rato endógeno são positivas apenas para marcador pan-microglial.
Em camundongos de controle, apenas microglia de camundongos foram detectadas tanto no córtex quanto no hipocampo. No córtex dos camundongos transplantados iPSMG, apenas microglia de camundongos foram detectadas, enquanto no hipocampo iPSMG foram detectados. Ao tentar este protocolo, a remoção completa do supernante é essencial para evitar a diluição de citocinas.
É crucial aplicar citocina a cada 12 horas para a viabilidade das células transplantadas. O esgotamento da microglia do rato endógeno é necessário para o transplante de iPSMG. Este procedimento permite o transplante de iPSMG em um cérebro de camundongo normal ou doente.
Assim, a característica do iPSMG, bem como a resposta à doença podem ser determinadas. Esta técnica é adequada para determinar a característica in vivo do iPSMG no cérebro do camundongo. Assim, o transplante de iPSMG em camundongos modelo de doença nos ajudará a entender a resposta e pode abrir caminho para um novo alvo terapêutico.
