このプロトコールは、CSF1受容体アンタゴニストPLX5622の薬理学的オン/オフと経鼻移植を組み合わせることにより、免疫適格マウス脳へのiPSMGの非侵襲的移植を可能にする。この技術の主な利点は、免疫適格マウスにおいても脳損傷を誘発することなくiPSMGを移植できることである。ミクログリア移植は、将来、様々な神経変性疾患において、機能不全のミクログリアを機能的なミクログリアと交換するための潜在的な治療法として役立つ可能性がある。
手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるBijay Parajuliです。まず、凍結した誘導多能性幹細胞由来ヒトミクログリア細胞を摂氏37度の水浴中で素早く解凍することから始める。目に見えるすべての氷が溶けるまでサンプルを渦巻きます。
解凍したiPSMGを培地に加え、摂氏37度に加温した。10ミリリットルの培養培地に1ミリリットルの細胞を加える。細胞を300倍gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。
細胞ペレットを乱すことなく上清を除去する。移植用培地を添加し、マイクロリットル当たり第5細胞に対して10の細胞濃度を得た。iPSMGを氷の上に置き、直ちに移植に進む。
経鼻移植用のマウスを準備するために、雄マウスにPLXを含む飼料を7日間給餌する。7日目の終わりに、PLXダイエットを中止し、マウスに通常の食事を与えてください。iPSMGの経鼻移植の1時間前に、10マイクロリットルのピペットチップを用いてPBS中の2.5マイクロリットルのヒアルロニダーゼを各鼻孔に2回投与し、鼻粘膜への透過性を高めた。
ヒアルロニダーゼ適用後の仰臥位にマウスを置く。iPSMGの経鼻移植の10分前に2.5マイクロリットルのヒアルロニダーゼを投与する。10マイクロリットルのピペットチップを使用して、マウスの1つの鼻孔に2.5マイクロリットルの細胞懸濁液を塗布する。
マウスを5分間仰臥位に置き、細胞懸濁液を他方の鼻孔に投与する。細胞懸濁液を4回投与し、1匹あたり20マイクロリットルの全容量を塗布する。PLX給餌の停止から48時間後、同じマウスにヒアルロニダーゼおよび細胞懸濁液の投与を繰り返す。
サイトカインの投与のために、10マイクロリットルのピペットチップを用いて、マウスの1つの鼻孔に2.5マイクロリットルの移植培地を塗布する。経鼻移植の2ヶ月後、移植細胞の数は、ヒト特異的マーカーおよび汎ミクログリアマーカーの両方に陽性である細胞を計数することによって決定することができる。内因性マウスミクログリアは、汎ミクログリアマーカーについてのみ陽性である。
対照マウスでは、マウスミクログリアのみが皮質および海馬の両方で検出された。iPSMG移植マウスの皮質では、マウスミクログリアのみが検出されたのに対し、海馬ではiPSMGが検出された。このプロトコールを試みる場合、サイトカインの希釈を防ぐために上清の完全な除去が不可欠である。
移植細胞の生存率のために12時間ごとにサイトカインを適用することが重要です。内因性マウスミクログリアの枯渇は、iPSMGの移植に必要である。この手順により、iPSMGを正常または罹患したマウス脳に移植することができる。
これにより、iPSMGの特徴ならびに疾患に対する応答性を決定することができる。この技術は、マウス脳におけるiPSMGのin vivo特性を決定するのに適している。したがって、iPSMGを疾患モデルマウスに移植することは、応答を理解するのに役立ち、新しい治療標的への道を開く可能性があります。
