השתלה של מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במוח עכברים מדוכאי חיסון דרך נתיב טרנסנסאלי לא פולשני

פרוטוקול זה מאפשר השתלה לא פולשנית של iPSMG במוח עכברים מדוכאי חיסון על ידי שילוב פרמקולוגי של הפעלה/כיבוי פרמקולוגית של אנטגוניסט לקולטן CSF1 PLX5622 עם השתלה טרנסנסאלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתיל iPSMG מבלי לגרום לנזק מוחי אפילו בעכברים חסרי יכולת חיסונית. השתלה מיקרוגליאלית עשויה לשמש כטיפול פוטנציאלי להחלפת מיקרוגליה לא מתפקדת עם אלה תפקודיים במחלות נוירודגנרטיביות שונות בעתיד.

מי שידגים את ההליך יהיה ביג'יי פרג'ולי, חוקר מהמעבדה שלי. התחילו בהפשרה מהירה של תאי המיקרוגליה האנושיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים קפואים באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס. סובבו את הדגימות עד שכל הקרח הנראה נמס.

הוסיפו את ה-iPSMG המופשר למדיה התרבותית, שחוממה ל-37 מעלות צלזיוס. הוסיפו מיליליטר אחד של תאים ל-10 מיליליטרים של מדיית תרבית. צנטריפוגה של התאים במהירות של 300 פעמים g במשך חמש דקות כדי לקבל גלולת תא.

הסר את חומר העל מבלי להפריע לכדור התא. הוסף את מדיום ההשתלה כדי לקבל ריכוז תאים של 10 לתאים החמישי לכל מיקרוליטר. מניחים את ה-iPSMG על הקרח, ומיד ממשיכים להשתלה.

כדי להכין עכברים להשתלת טרנסנסאל, האכילו את העכברים הזכרים בתזונה המכילה PLX במשך שבעה ימים. בסוף היום השביעי, להפסיק את דיאטת PLX ולהאכיל את העכברים עם דיאטה רגילה. שעה לפני ההשתלה הטרנסנזלית של iPSMG, תנו 2.5 מיקרוליטרים של היאלורונידאז ב-PBS לכל נחיר פעמיים באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להגביר את החדירות לרירית האף.

מניחים את העכברים במצב שכיבה לאחר מריחת ההיאלורונידאז. תן 2.5 מיקרוליטרים של היאלורונידאז עשר דקות לפני השתלת טרנסנסאל של iPSMG. יש למרוח 2.5 מיקרוליטרים של תרחיף תאים על נחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר.

מניחים את העכבר בתנוחת השכיבה במשך חמש דקות לפני מתן ההשעיה של התא לנחיריים האחרים. נהל את תרחיף התא ארבע פעמים, תוך החלת נפח כולל של 20 מיקרוליטרים לכל חיה. 48 שעות לאחר הפסקת ההזנה של PLX, חזרו על מתן היאלורונידאז ותרחיף התאים על אותם עכברים.

למתן ציטוקינים, יש למרוח 2.5 מיקרוליטרים של מדיום ההשתלה על נחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר. לאחר חודשיים של השתלה טרנסנסאלית, ניתן לקבוע את מספר התאים המושתלים על ידי ספירת תאים חיוביים הן לסמנים ספציפיים לבני אדם והן לסמנים פאן-מיקרוגליאליים. מיקרוגליה של עכברים אנדוגניים חיובית עבור סמן פאן-מיקרוגליאלי בלבד.

בעכברי בקרה זוהו רק מיקרוגליה של עכברים הן בקליפת המוח והן בהיפוקמפוס. בקליפת המוח של עכברים מושתלים iPSMG זוהו רק מיקרוגליה של עכברים, ואילו בהיפוקמפוס iPSMG זוהו. כאשר מנסים את הפרוטוקול הזה, הסרה מלאה של סופרנאטנט חיונית כדי למנוע דילול של ציטוקינים.

חשוב מאוד למרוח ציטוקינים כל 12 שעות על הכדאיות של תאים מושתלים. דלדול של מיקרוגליה של עכבר אנדוגני נדרש להשתלת iPSMG. הליך זה מאפשר השתלה של iPSMG לתוך מוח עכבר רגיל או חולה.

לפיכך, ניתן לקבוע את המאפיין של iPSMG כמו גם את התגובה למחלה. טכניקה זו מתאימה כדי לקבוע את המאפיין in vivo של iPSMG במוח העכבר. לפיכך, השתלת iPSMG בעכברים במודל מחלה תסייע לנו להבין את התגובה ועשויה לסלול את הדרך למטרה טיפולית חדשה.