Este protocolo permite un trasplante no invasivo de iPSMG en cerebro de ratón inmunocompetente mediante la combinación de encendido / apagado farmacológico de un antagonista del receptor CSF1 PLX5622 con trasplante transnasal. La principal ventaja de esta técnica es que iPSMG se puede trasplantar sin inducir daño cerebral incluso en ratones inmunocompetentes. El trasplante microglial puede servir como una terapia potencial para intercambiar microglía disfuncional con microglías funcionales en diversas enfermedades neurodegenerativas en el futuro.
Demostrando el procedimiento estará Bijay Parajuli, un investigador de mi laboratorio. Comience por descongelar rápidamente las células de microglía humana derivadas de células madre pluripotentes inducidas congeladas en un baño de agua de 37 grados Celsius. Gire las muestras hasta que todo el hielo visible se haya derretido.
Agregue el iPSMG descongelado a los medios de cultivo, calentado a 37 grados centígrados. Agregue un mililitro de células a 10 mililitros de medios de cultivo. Centrifugar las células a 300 veces g durante cinco minutos para obtener un pellet celular.
Retire el sobrenadante sin perturbar la bolita celular. Añadir el medio de trasplante para obtener una concentración celular de 10 a la quinta célula por microlitro. Coloque el iPSMG en hielo e inmediatamente proceda al trasplante.
Para preparar a los ratones para el trasplante transnasal, alimente a los ratones machos con una dieta que contenga PLX durante siete días. Al final del séptimo día, suspenda la dieta PLX y alimente a los ratones con una dieta normal. Una hora antes del trasplante transnasal de iPSMG, administre 2,5 microlitros de hialuronidasa en PBS a cada fosa nasal dos veces utilizando una punta de pipeta de 10 microlitros para aumentar la permeabilidad a la mucosa nasal.
Coloque a los ratones en posición supina después de la aplicación de hialuronidasa. Administrar 2,5 microlitros de hialuronidasa diez minutos antes del trasplante transnasal de iPSMG. Aplique 2,5 microlitros de suspensión celular en una fosa nasal del ratón con una punta de pipeta de 10 microlitros.
Coloque el ratón en posición supina durante cinco minutos antes de la administración de suspensión celular a la otra fosa nasal. Administrar la suspensión celular cuatro veces, aplicando un volumen total de 20 microlitros por animal. 48 horas después del cese de la alimentación con PLX, repetir la administración de hialuronidasa y suspensión celular en los mismos ratones.
Para la administración de citoquinas, aplique 2,5 microlitros del medio de trasplante en una fosa nasal del ratón utilizando una punta de pipeta de 10 microlitros. Después de dos meses de trasplante transnasal, el número de células trasplantadas se puede determinar contando las células que son positivas tanto para marcadores específicos humanos como panmicrogliales. Las microglías endógenas de ratón son positivas solo para el marcador pan-microglial.
En ratones de control, solo se detectaron microglia de ratón tanto en la corteza como en el hipocampo. En la corteza de los ratones trasplantados con iPSMG, solo se detectaron microglías de ratón, mientras que en el hipocampo se detectaron iPSMG. Al intentar este protocolo, la eliminación completa del sobrenadante es esencial para evitar la dilución de las citoquinas.
Es crucial aplicar citoquinas cada 12 horas para la viabilidad de las células trasplantadas. Se requiere el agotamiento de la microglía endógena del ratón para el trasplante de iPSMG. Este procedimiento permite el trasplante de iPSMG en un cerebro de ratón normal o enfermo.
Por lo tanto, se pueden determinar las características de iPSMG, así como la respuesta a la enfermedad. Esta técnica es adecuada para determinar la característica in vivo de iPSMG en el cerebro del ratón. Por lo tanto, el trasplante de iPSMG en ratones modelo de enfermedad nos ayudará a comprender la respuesta y puede allanar el camino para una nueva diana terapéutica.
