يحدد هذا البروتوكول التقنيات المستخدمة لإنتاج فيروس مرض نيوكاسل بحيث يمكن إعطاؤه بأمان للفئران والحيوانات الأخرى مثل الهامستر والأغنام. يسمح استخدام ترشيح التدفق العرضي بمعالجة أحجام البدء الكبيرة بشكل أكثر كفاءة مقارنة بالإجراءات الحالية التي تستخدم عمليات الطرد المركزي فقط. هذا إجراء طويل يتضمن عدة خطوات معقدة ، مما يعني أن إدارة الوقت قد تكون مشكلة.
أوصي بتحديد جميع خطوات التوقف المؤقت المحتملة بحيث يمكن تقسيم التقنية بشكل مناسب ، مما يقلل من التوتر. سيوضح هذا الإجراء أليكس ، مساعد باحث من مختبري. لتنقية فيروس مرض نيوكاسل أو NDV ، أولا ، قم بتمهيد النظام التجريبي الذي تم تعيينه مسبقا عن طريق تشغيل 50 ملليلتر من PBS من خلاله.
أوقف المضخة عند ترك ما يقرب من خمسة ملليلترات من PBS في الأنبوب. بعد ذلك ، قم بإرفاق مرشح عمق مع تصنيف واحد إلى ثلاثة ميكرومولار للاحتفاظ بالأنابيب. للتنفيس عن الفلتر ، قم بإزالة الغطاء الثاني على الجانب الملحمي من مرشح العمق ثم ابدأ في تشغيل 50 ملليلتر إضافي من PBS عبر النظام.
بمجرد أن يبدأ PBS في التدفق عبر فتحة التهوية الموجودة أعلى الفلتر ، أغلق المنفذ واستمر في تدفق PBS عبر الخطوط. بعد ذلك ، استبدل وعاء النفايات بوعاء تجميع معقم جديد وابدأ في تشغيل Allantoic Fluid من خلال مرشح العمق. بعد ذلك ، قم بإعداد ترشيح التدفق العرضي أو نظام TFF في تأكيد مفتوح وتشغيله كما هو موضح في المخطوطة.
عندما يكون هناك حوالي خمسة ملليلترات من السائل المتبقي في الخزان ، أوقف المضخة مؤقتا وأضف سائل Allantoic المصفى إلى الخزان. ثم استئناف تدفق المضخة. لمنع قص الفيروس ، من المهم التأكد من أن ضغط النظام لا يتجاوز 10 رطل لكل بوصة مربعة.
لزيادة الوهم ، يجب استخدام مزيج من سرعة المضخة التمعجية والمشبك C. يتم ترك 150 إلى 100 ملليلتر من سائل Allantoic في الخزان ، وإيقاف المضخة مؤقتا وتبادل المخزن المؤقت عن طريق إضافة 150 إلى 200 ملليلتر من المخزن المؤقت ML. مرة أخرى ، أوقف المضخة مؤقتا عند ترك خمسة إلى 10 ملليلتر من السوائل في الخزان ، ثم استخدم اثنين من المشابك C بالقرب من محيط الخصر.
قم بفصل الخط المتردد الذي يغذي الخزان وأدخله في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. ثم استأنف التدفق وتوقف مؤقتا عندما يكون هناك بضع قطرات من السائل المتبقي في خزان الخزان. بعد ذلك ، قم بإزالة المشابك C من خطوط النفايات وأعد توصيل خط التغذية المعاد تثبيته بخزان الخزان.
وفي الوقت نفسه ، للتحضير لتدرج كثافة اليوديكسانول للطرد المركزي ، أضف أولا 0.5 ملليلتر من 40٪ من اليوديكسانول إلى أنبوب طرد مركزي رفيع الجدار مفتوح 13.2 ملليلتر. ثم اجعل العمود جاهزا مع إضافات متتالية من 2.5 ملليلتر من 20 ٪ من اليوديكسانول ، و 2.5 ملليلتر من 10 ٪ من اليوديكسانول. قبل الطرد المركزي الفائق ، أضف بعناية ستة إلى 6.5 ملليلتر من محلول الفيروس المشار إليه من نظام TFF إلى عمود اليوديكسانول دون إزعاج التدرج.
بعد الطرد المركزي الفائق ، قم بإزالة الأنابيب بزوج من الملقط المعقم. يجب أن يكون النطاق المستهدف نطاقا كبيرا بين التدرجات 10 و 20٪. بعد ذلك ، قم بتعليق الأنبوب فوق الجزء العلوي من الكأس باستخدام حامل معوجة.
بعد ذلك ، قم بتوصيل إبرة مقاس 1.5 بوصة بمقياس 18 بحقنة سعة خمسة ملليلتر ثم ثقب جانب أنبوب الطرد المركزي الفائق بالإبرة وقم بإزالة الشريط المستهدف عن طريق تمديد المكبس ببطء. بعد إزالة اليوديكسانول من محلول الفيروس كما هو موضح في المخطوطة ، استخدم حقنة لحقن الفيروس بعناية في كاسيت غسيل الكلى. لتركيز محلول الفيروس، قم بإزالة كاسيت غسيل الكلى من المخزن المؤقت لغسيل الكلى وضعه في كيس بلاستيكي صغير قابل للإغلاق.
ثم أضف 15 إلى 25 ملليلتر من 40٪ من البولي إيثيلين جلايكول إلى الكيس بحيث يتم غمر كاسيت غسيل الكلى بالكامل. بعد غسيل الكلى شطف لفترة وجيزة كاسيت غسيل الكلى مع PBS. بعد ذلك ، املأ حقنة مزودة بإبرة مقاس 1.5 بوصة بمقياس 18 بالهواء ، وأدخل المحقنة في كاسيت غسيل الكلى وادفع المكبس.
قم بتدوير الجهاز لإزالة الفيروس دون إزالة أي من الهواء المدخل. لإزاحة الفيروس المتبقي الملتصق بالغشاء ، قم بتدليك الغشاء بعناية بأصابع القفاز دون إتلافه. لتسهيل عملية الإزاحة، قم بإزالة بعض الهواء الزائد في كاسيت غسيل الكلى.
بالنسبة لفحوصات مراقبة الجودة ، أولا ، قم بتخفيف محلول الفيروس 100 مرة عن طريق إضافة 10 ميكرولترات منه إلى 990 ميكرولتر من PBS في أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم استمر في التخفيف التسلسلي بإضافة 100 ميكرولتر من التخفيف السابق إلى 900 ميكرولتر من PBS. لفحوصات العدوى ، أضف 20 ميكرولتر من كل وهم إلى كل بئر من صفيحة البئر 96.
قبل فحص تأثير الاعتلال الخلوي لبروتين التألق الأخضر ، أو إجراء فحص التألق المناعي غير المباشر ، احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة على الأقل. باستخدام هذا البروتوكول ، تم الحصول على NDV عالي النقاء كما هو موضح في كبريتات الصوديوم polyacrylamide هلام الكهربائي للبروتينات الفيروسية. كما تم التحقق من عدوى الفيروس الذي تم تنقيته بهذه الطريقة من خلال جرعة عدوى زراعة الأنسجة بنسبة 50٪ أو فحص TCID50 الذي تم إجراؤه في 96 لوحة بئر.
تم تحديد TCID50 من عدد الآبار الموجبة لكل تخفيف باستخدام آلة حاسبة سبيرمان-كاربر. كشف فحص العدوى عن الفرق بين التأثيرات الخلوية ل NDV العدسي و mesogenic على خلية DF واحدة في ظل ظروف مختلفة بعد 10 و 24 ساعة من الحضانة. كان فحص فلورنسا المناعي فعالا أيضا في دراسة عدوى خلايا فيرو بواسطة NDV العدسي.
عند تحضير النظام التجريبي ، تأكد من أن الخطوط جاهزة بشكل فعال لأن أي هيدروكسيد الصوديوم المتبقي سيؤدي إلى تعطيل الفيروس. من المهم أيضا الحفاظ على سلامة الغشاء لأن المساس بذلك سيضعف بشكل كبير تنقية الفيروس وإنتاجه.
