이 프로토콜은 뉴캐슬병 바이러스를 생산하는 데 사용되는 기술을 간략하게 설명하여 쥐 및 햄스터 및 양과 같은 다른 동물에게 안전하게 투여 할 수 있도록합니다. 접선 유동 여과를 사용하면 원심분리 공정만 사용하는 기존 절차에 비해 대량의 시작 부피를 보다 효율적으로 처리할 수 있습니다. 이는 몇 가지 복잡한 단계가 포함된 긴 절차로, 시간 관리가 문제가 될 수 있습니다.
모든 잠재적 인 일시 중지 단계를 식별하여 기술을 적절하게 분할하여 스트레스를 최소화 할 수 있도록하는 것이 좋습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 조교 인 알렉스 (Alex)가 될 것입니다. 뉴캐슬병 바이러스 또는 NDV의 정제를 위해, 먼저, 이를 통해 50 밀리리터의 PBS를 실행함으로써 이전에 설정된 실험 시스템을 프라임화한다.
약 다섯 밀리리터의 PBS가 튜브에 남아 있을 때 펌프를 정지시키십시오. 다음으로, 하나 내지 세 개의 마이크로몰 보유 등급을 갖는 깊이 필터를 튜빙에 부착한다. 필터를 배출하려면 깊이 필터의 에피컬 쪽에 있는 두 번째 캡을 제거한 다음 시스템을 통해 50밀리리터의 PBS를 추가로 실행하기 시작합니다.
PBS가 필터 상단의 통풍구를 통해 흐르기 시작하면 포트를 닫고 PBS를 라인을 통해 계속 흐르십시오. 그 후 폐기물 용기를 새로운 멸균 수집 용기로 교체하고 깊이 필터를 통해 Allantoic Fluid를 실행하기 시작하십시오. 다음으로, 접선 유동 여과 또는 TFF 시스템을 공개 확인에서 설정하고 원고에 설명 된대로 실행하십시오.
저수지에 약 다섯 밀리리터의 유체가 남아 있으면 펌프를 일시 중지하고 깊이 여과 된 Allantoic Fluid를 저장소에 추가하십시오. 그런 다음 펌프 흐름을 재개하십시오. 바이러스의 전단을 방지하려면 시스템의 압력이 평방 인치당 10 파운드의 힘을 초과하지 않도록하는 것이 중요합니다.
환상을 높이려면 연동 펌프와 C 클램프의 속도를 조합하여 사용해야합니다. 150 ~ 100 밀리리터의 Allantoic Fluid가 저장소에 남아 펌프를 일시 중지하고 150 ~ 200 밀리리터의 ML 버퍼를 추가하여 버퍼를 교환합니다. 다시 말하지만, 다섯 ~ 10 밀리리터의 유체가 저수지에 남아있을 때 펌프를 일시 중지 한 다음 두 개의 C 클램프를 사용하여 허리 둘레를 닫습니다.
저수지에 공급되는 고정 라인을 분리하고 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 삽입하십시오. 그런 다음 흐름을 재개하고 저수지 탱크에 몇 방울의 유체가 남아 있으면 일시 중지하십시오. 다음으로, 폐기물 라인에서 C 클램프를 제거하고 보유 된 공급 라인을 저수지 탱크에 다시 부착하십시오.
한편, 요오드딕사놀 밀도 구배 초원심분리를 준비하기 위해, 먼저 0.5밀리리터의 40% 요오딕사놀을 13.2밀리리터 개방 상부 얇은 벽 울트라 원심분리 튜브에 첨가한다. 그런 다음 2.5 밀리리터의 20 % iodixanol과 2.5 밀리리터의 10 % iodixanol을 연속적으로 첨가하여 컬럼을 준비하십시오. 초원심분리 전에 TFF 시스템에서 암시 된 바이러스 용액 6 ~ 6.5 밀리리터를 구배를 방해하지 않고 요오드딕사놀 컬럼에 조심스럽게 첨가하십시오.
초원심분리 후, 한 쌍의 멸균 포셉으로 튜브를 제거하십시오. 대상 밴드는 10과 20% 그라디언트 사이의 큰 밴드여야 합니다. 다음으로, 레토르트 스탠드를 사용하여 튜브를 비이커 상단에 매달아 놓습니다.
그 후, 18 게이지의 1.5 인치 바늘을 5 밀리리터 주사기에 부착 한 다음 바늘로 초원심분리 튜브의 측면을 펑크하고 플런저를 천천히 연장하여 대상 밴드를 제거하십시오. 원고에 설명 된대로 바이러스 용액에서 요오드릭사놀을 제거한 후 주사기를 사용하여 바이러스를 투석 카세트에 조심스럽게 주입하십시오. 바이러스 용액을 농축하려면 투석 버퍼에서 투석 카세트를 제거하고 밀봉 가능한 작은 비닐 봉지에 넣으십시오.
그런 다음 투석 카세트가 완전히 잠기도록 15 ~ 25 밀리리터의 40 % 폴리에틸렌 글리콜을 가방에 넣으십시오. 투석 후 투석 카세트를 PBS로 간단히 헹구었다. 다음으로, 18 게이지의 1.5 인치 바늘이 장착 된 주사기를 공기로 채우고 주사기를 투석 카세트에 넣고 플런저를 밀어 넣으십시오.
도입된 공기 중 어느 것도 제거하지 않고 바이러스를 제거하기 위한 장치를 회전시킨다. 멤브레인에 부착 된 잔류 바이러스를 제거하려면 멤브레인을 손상시키지 않고 장갑을 낀 손가락으로 조심스럽게 마사지하십시오. 하역 과정을 쉽게하려면 투석 카세트에서 과도한 공기 중 일부를 제거하십시오.
품질 관리 분석을 위해, 먼저, 1.5 밀리리터 튜브에서 990 마이크로리터의 PBS에 10 마이크로리터를 첨가하여 바이러스 용액을 100배 희석한다. 이어서, 이전 희석액의 100 마이크로리터를 PBS의 900 마이크로리터에 첨가함으로써 연속 희석을 계속한다. 감염 분석을 위해, 96 웰 플레이트의 각 웰에 각 망상의 20 마이크로리터를 첨가한다.
녹색 형광 단백질의 세포 변성 효과를 조사하거나 간접 면역 형광 분석을 수행하기 전에 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 48시간 이상 인큐베이션한다. 이 프로토콜을 사용함으로써, 고도로 정제된 NDV는 바이러스 단백질의 소듐 도설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 입증된 바와 같이 수득되었다. 이 방법에 의해 정제된 바이러스의 감염성은 또한 96 웰 플레이트에서 행해진 50% 조직 배양 감염 용량 또는 TCID50 검정에 의해 검증되었다.
TCID50은 Spearman-Karber 계산기를 사용하여 각 희석에 대한 양성 웰의 수로부터 결정되었다. 감염 분석은 10 및 24 시간의 인큐베이션 후 상이한 조건하에서 DF 한 세포에 대한 렌토제닉 및 메소제닉 NDV의 세포변성 효과의 차이를 밝혀냈다. 면역 플로렌스 분석은 또한 렌토제닉 NDV에 의한 베로 세포의 감염을 연구하는데 효과적이었다.
실험 시스템을 프라이밍 할 때, 잔류 수산화 나트륨이 바이러스를 불활성화시킬 것이므로 라인이 효과적으로 프라이밍되도록하십시오. 또한 이를 손상시키는 것이 바이러스 정제 및 수율을 현저하게 손상시킬 수 있으므로 막 완전성을 유지하는 것이 중요하다.
