Dieses Protokoll beschreibt die Techniken, die zur Herstellung des Newcastle-Disease-Virus verwendet werden, damit es Mäusen und anderen Tieren wie Hamstern und Schafen sicher verabreicht werden kann. Durch den Einsatz der tangentialen Strömungsfiltration können große Startvolumina im Vergleich zu bestehenden Verfahren, die nur Zentrifugationsverfahren verwenden, effizienter verarbeitet werden. Dies ist ein langwieriges Verfahren mit mehreren komplizierten Schritten, was bedeutet, dass das Zeitmanagement ein Problem sein kann.
Ich würde empfehlen, alle potenziellen Pausenschritte zu identifizieren, damit die Technik angemessen aufgeteilt werden kann, wodurch der Stress minimiert wird. Dieses Verfahren wird Alex, ein Forschungsassistent aus meinem Labor, demonstrieren. Für die Reinigung des Newcastle Disease Virus oder NDV bereiten Sie zunächst das zuvor festgelegte experimentelle System vor, indem Sie 50 Milliliter PBS durchlaufen.
Stoppen Sie die Pumpe, wenn etwa fünf Milliliter PBS im Rohr verbleiben. Als nächstes befestigen Sie einen Tiefenfilter mit einer mikromolaren Retentionsrate von ein bis drei an den Schläuchen. Um den Filter zu entlüften, entfernen Sie die zweite Kappe auf der epischen Seite des Tiefenfilters und beginnen Sie dann, zusätzliche 50 Milliliter PBS durch das System laufen zu lassen.
Sobald der PBS beginnt, durch die Entlüftung an der Oberseite des Filters zu fließen, schließen Sie den Anschluss und fahren Sie fort, PBS durch die Leitungen zu fließen. Danach ersetzen Sie das Abfallgefäß durch ein neues steriles Sammelgefäß und beginnen Sie, Allantoic Fluid durch den Tiefenfilter zu führen. Als nächstes richten Sie die tangentiale Strömungsfiltration oder das TFF-System in einer offenen Bestätigung ein und führen Sie sie wie im Manuskript beschrieben aus.
Wenn sich noch etwa fünf Milliliter Flüssigkeit im Reservoir befinden, pausieren Sie die Pumpe und fügen Sie dem Reservoir tiefengefilterte Allantoic Fluid hinzu. Nehmen Sie dann den Pumpendurchfluss wieder auf. Um das Scheren des Virus zu verhindern, ist es wichtig sicherzustellen, dass der Druck des Systems 10 Pfund Kraft pro Quadratzoll nicht überschreitet.
Um die Illusion zu erhöhen, sollte eine Kombination aus der Drehzahl der Peristaltikpumpe und der C-Klemme verwendet werden. 150 bis 100 Milliliter Allantoic Fluid verbleiben im Reservoir, pausieren Sie die Pumpe und tauschen Sie den Puffer durch Zugabe von 150 bis 200 Milliliter ML-Puffer aus. Halten Sie die Pumpe erneut an, wenn fünf bis 10 Milliliter Flüssigkeit im Reservoir verbleiben, und schließen Sie dann mit zwei C-Klemmen die Taille.
Entkoppeln Sie die festsitzende Leitung, die den Behälter speist, und führen Sie sie in ein 50-Milliliter-Konusrohr ein. Nehmen Sie dann den Fluss wieder auf und pausieren Sie, wenn nur noch wenige Flüssigkeitstropfen im Reservoirtank vorhanden sind. Entfernen Sie als Nächstes die C-Klemmen von den Abfallleitungen und befestigen Sie die zurückgehaltene Zuleitung wieder am Reservoirtank.
Um sich auf die Ultrazentrifugation des Iodixanol-Dichtegradienten vorzubereiten, fügen Sie zunächst 0,5 Milliliter 40% iodixanol zu einem 13,2 Milliliter offenen dünnwandigen Ultrazentrifugenröhrchen hinzu. Dann machen Sie die Säule mit aufeinanderfolgenden Zugaben von 2,5 Millilitern 20% Jodixanol und 2,5 Millilitern 10% Iodixanol fertig. Vor der Ultrazentrifugation sechs bis 6,5 Milliliter der aus dem TFF-System angedeuteten Viruslösung vorsichtig in die Iodixanol-Säule geben, ohne den Gradienten zu stören.
Entfernen Sie nach der Ultrazentrifugation die Röhrchen mit einer sterilen Pinzette. Das Zielband sollte ein großes Band zwischen den Gradienten von 10 und 20% sein. Als nächstes hängen Sie das Rohr mit einem Retortenständer über die Oberseite eines Becherglases.
Danach befestigen Sie eine 1,5-Zoll-Nadel von 18 Gauge an einer Fünf-Milliliter-Spritze, durchstechen Sie dann die Seite des Ultrazentrifugenröhrchens mit der Nadel und entfernen Sie das Zielband, indem Sie den Kolben langsam verlängern. Nachdem Sie Iodixanol aus der Viruslösung entfernt haben, wie im Manuskript beschrieben, verwenden Sie eine Spritze, um das Virus vorsichtig in eine Dialysekassette zu injizieren. Um die Viruslösung zu konzentrieren, nehmen Sie die Dialysekassette aus dem Dialysepuffer und legen Sie sie in einen kleinen verschließbaren Plastikbeutel.
Dann geben Sie einen 15 bis 25 Milliliter 40% Polyethylenglykol in den Beutel, so dass die Dialysekassette vollständig untergetaucht ist. Nach der Dialyse die Dialysekassette kurz mit PBS abspülen. Als nächstes füllen Sie eine Spritze, die mit einer 1,5-Zoll-Nadel von 18 Gauge ausgestattet ist, mit Luft, setzen Sie die Spritze in die Dialysekassette ein und drücken Sie den Kolben.
Drehen Sie das Gerät zum Entfernen des Virus, ohne die eingebrachte Luft zu entfernen. Um das an der Membran haftende Restvirus zu entfernen, massieren Sie die Membran vorsichtig mit behandschuhten Fingern, ohne sie zu beschädigen. Um den Verdrängungsprozess zu erleichtern, entfernen Sie einen Teil der überschüssigen Luft in der Dialysekassette.
Für Qualitätskontrollassays verdünnen Sie zunächst die Viruslösung 100 Mal, indem Sie 10 Mikroliter davon zu 990 Mikrolitern PBS in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzufügen. Fahren Sie dann mit der seriellen Verdünnung fort, indem Sie 100 Mikroliter der vorherigen Verdünnung zu 900 Mikrolitern PBS hinzufügen. Für Infektionsassays fügen Sie 20 Mikroliter jeder Wahnvorstellung zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu.
Bevor Sie die zytopathische Wirkung von grünem Fluoreszenzprotein untersuchen oder einen indirekten Immunfluoreszenztest durchführen, inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für mindestens 48 Stunden. Durch die Verwendung dieses Protokolls wurde hochgereinigtes NDV erhalten, wie durch Natrium-Do-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der viralen Proteine gezeigt wurde. Die Infektiosität des mit dieser Methode gereinigten Virus wurde auch durch die 50%ige Gewebekulturinfektionsdosis oder den TCID50-Assay in 96 Well-Platten verifiziert.
Der TCID50 wurde aus der Anzahl der positiven Vertiefungen für jede Verdünnung mit dem Spearman-Karber-Rechner bestimmt. Der Infektionsassay zeigte den Unterschied zwischen den zytopathischen Wirkungen von lentogener und mesogener NDV auf DF-Ein-Zellen unter verschiedenen Bedingungen nach 10 und 24 Stunden Inkubation. Der Immun-Florence-Assay war auch wirksam bei der Untersuchung der Infektion von Vero-Zellen durch lentogene NDV.
Stellen Sie bei der Grundierung des experimentellen Systems sicher, dass die Linien effektiv vorbereitet werden, da jedes verbleibende Natriumhydroxid das Virus inaktiviert. Es ist auch wichtig, die Integrität der Membran aufrechtzuerhalten, da dies die Virusreinigung und -ausbeute erheblich beeinträchtigt.
