このプロトコルは、ニューカッスル病ウイルスを産生するために使用される技術を概説し、マウスおよびハムスターおよびヒツジなどの他の動物に安全に投与することができる。タンジェンシャルフローろ過を使用することで、遠心分離プロセスのみを使用する既存の手順と比較して、大量の開始ボリュームをより効率的に処理できます。これは、いくつかの複雑なステップを含む長い手順であり、時間管理が問題になる可能性があります。
私は、テクニックを適切に分割し、ストレスを最小限に抑えることができるように、すべての潜在的な一時停止ステップを特定することをお勧めします。この手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるアレックスです。ニューカッスル病ウイルスまたはNDVの精製のために、まず、50ミリリットルのPBSをそれを通して実行することによって、以前に設定された実験系をプライムする。
約5ミリリットルのPBSがチューブに残っているときにポンプを停止します。次に、1〜3マイクロモルの保持定格のデプスフィルターをチューブに取り付けます。フィルターを通気するには、深度フィルターのエピカル側にある 2 番目のキャップを取り外し、さらに 50 ミリリットルの PBS をシステム内で実行し始めます。
PBS がフィルター上部の通気口を流れ始めたら、ポートを閉じ、PBS をラインに流し続けます。その後、廃棄物容器を新しい滅菌回収容器に交換し、デプスフィルターを通してアラントイック流体を流し始めます。次に、オープン確認で接線フローろ過またはTFFシステムを設定し、原稿の説明に従って実行します。
リザーバに約5ミリリットルの流体が残っている場合は、ポンプを一時停止し、深さろ過されたアラントイック流体をリザーバに追加します。その後、ポンプの流れを再開します。ウイルスのせん断を防ぐには、システムの圧力が平方インチあたり10ポンドの力を超えないようにすることが重要です。
錯覚を高めるためには、蠕動ポンプの速度とCクランプの組み合わせを使用する必要があります。150〜100ミリリットルのアラントイック流体がリザーバに残され、ポンプを一時停止し、150〜200ミリリットルのMLバッファーを加えてバッファーを交換します。ここでも、5〜10ミリリットルの液体がリザーバに残っているときにポンプを一時停止し、2つのCクランプを使用してウエストラインを閉じます。
リザーバに供給する保持ラインを結合解除し、50ミリリットルの円錐形チューブに挿入します。その後、流れを再開し、リザーバタンクに残っている流体の滴がほとんどないときに一時停止します。次に、廃棄物ラインからCクランプを取り外し、保持された供給ラインをリザーバタンクに取り付け直します。
一方、イオジキサノール密度勾配超遠心のために準備するために、まず0.5ミリリットルの40%ヨージキサノールを13.2ミリリットルのオープントップ薄壁超遠心管に加える。次に、2.5ミリリットルの20%イオジキサノール、および2.5ミリリットルの10%ヨージキサノールを連続して添加してカラムを準備します。超遠心分離の前に、勾配を乱すことなく、TFFシステムから暗示された6〜6.5ミリリットルのウイルス溶液をヨウジキサノールカラムに慎重に添加します。
超遠心分離後、一対の滅菌鉗子でチューブを取り外す。ターゲット バンドは、10 ~ 20% のグラデーションの間の大きなバンドにする必要があります。次に、レトルトスタンドを使用してビーカーの上にチューブを吊り下げます。
その後、18ゲージの1.5インチ針を5ミリリットルのシリンジに取り付け、超遠心管の側面を針で穿刺し、プランジャーをゆっくりと伸ばしてターゲットバンドを除去します。原稿に記載されているようにウイルス溶液からヨウジキサノールを除去した後、シリンジを使用して透析カセットにウイルスを慎重に注入する。ウイルス液を濃縮するには、透析バッファーから透析カセットを取り出し、小さな密封可能なビニール袋に入れます。
次に、透析カセットが完全に水没するように、15〜25ミリリットルの40%ポリエチレングリコールをバッグに加える。透析後、透析カセットをPBSで短時間すすいでください。次に、18ゲージの1.5インチ針を取り付けたシリンジに空気を満たし、シリンジを透析カセットに挿入し、プランジャーを押します。
導入された空気を一切取り除かずにウイルスを除去するための装置を回転させる。膜に付着した残留ウイルスを取り除くには、手袋をはめた指で膜を傷つけずに慎重にマッサージしてください。脱落プロセスを容易にするために、透析カセット内の余分な空気の一部を除去します。
品質管理アッセイのために、まず、1.5ミリリットルのチューブ内の990マイクロリットルのPBSに10マイクロリットルのウイルス溶液を加えて、ウイルス溶液を100倍に希釈する。次いで、900マイクロリットルのPBSに前の希釈液の100マイクロリットルを加えて段階希釈を続ける。感染アッセイの場合、96ウェルプレートの各ウェルに20マイクロリットルの各妄想を加える。
緑色蛍光タンパク質の細胞変性効果を調べる前に、または間接免疫蛍光アッセイを行う前に、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素と共に少なくとも48時間インキュベートする。このプロトコールを用いることにより、ウイルスタンパク質の硫酸ナトリウムドポリアクリルアミドゲル電気泳動によって実証されるように高度に精製されたNDVが得られた。この方法によって精製されたウイルスの感染力は、96ウェルプレートで行われた50%組織培養感染用量またはTCID50アッセイによっても検証された。
TCID50を、スピアマン・カーバー計算機を用いて各希釈液の陽性ウェル数から求めた。感染アッセイは、インキュベーションの10時間および24時間後に異なる条件下でDF1つの細胞に対するレントゲン性およびメソゲン性NDVの細胞変性効果の違いを明らかにした。免疫フローレンスアッセイは、レントゲン性NDVによるVero細胞の感染を研究するのにも有効であった。
実験系をプライミングするときは、残留水酸化ナトリウムがウイルスを不活性化するため、ラインが効果的にプライミングされていることを確認してください。また、これを損なうとウイルスの精製および収量を著しく損なうため、膜の完全性を維持することも重要である。
