Este protocolo describe las técnicas utilizadas para producir el virus de la enfermedad de Newcastle para que pueda administrarse de forma segura a ratones y otros animales como hámsters y ovejas. El uso de la filtración de flujo tangencial permite que los grandes volúmenes de partida se procesen de manera más eficiente en comparación con los procedimientos existentes que utilizan solo procesos de centrifugación. Este es un procedimiento largo que implica varios pasos intrincados, lo que significa que la gestión del tiempo puede ser un problema.
Recomendaría identificar todos los posibles pasos de pausa para que la técnica se pueda dividir adecuadamente, minimizando el estrés. Demostrando este procedimiento estará Alex, un asistente de investigación de mi laboratorio. Para la purificación del virus de la enfermedad de Newcastle o NDV, primero, prepare el sistema experimental previamente establecido ejecutando 50 mililitros de PBS a través de él.
Detenga la bomba cuando queden aproximadamente cinco mililitros de PBS en el tubo. A continuación, conecte un filtro de profundidad con una clasificación de retención micromolar de uno a tres al tubo. Para ventilar el filtro, retire la segunda tapa en el lado epical del filtro de profundidad y luego comience a ejecutar 50 mililitros adicionales de PBS a través del sistema.
Una vez que el PBS comience a fluir a través de la ventilación en la parte superior del filtro, cierre el puerto y continúe fluyendo PBS a través de las líneas. Después de eso, reemplace el recipiente de desechos con un nuevo recipiente de recolección estéril y comience a pasar el líquido alantoico a través del filtro de profundidad. A continuación, configure el sistema de filtración de flujo tangencial o TFF en una confirmación abierta y ejecute como se describe en el manuscrito.
Cuando queden unos cinco mililitros de líquido en el depósito, detenga la bomba y agregue líquido alantoico filtrado en profundidad al depósito. A continuación, reanude el flujo de la bomba. Para evitar el cizallamiento del virus, es importante asegurarse de que la presión del sistema no exceda la fuerza de 10 libras por pulgada cuadrada.
Para aumentar la ilusión, se debe usar una combinación de la velocidad de la bomba peristáltica y la abrazadera C. Se dejan de 150 a 100 mililitros de líquido alantoico en el depósito, pausa la bomba e intercambia el tampón agregando de 150 a 200 mililitros de tampón ML. Una vez más, detenga la bomba cuando queden de cinco a 10 mililitros de líquido en el depósito, luego use dos abrazaderas en C para cerrar la cintura.
Desacople la línea retenida que alimenta el depósito e insértela en un tubo cónico de 50 mililitros. Luego reanude el flujo y haga una pausa cuando queden pocas gotas de líquido en el tanque del depósito. A continuación, retire las abrazaderas C de las líneas de residuos y vuelva a conectar la línea de alimentación retenida al tanque del depósito.
Mientras tanto, para prepararse para la ultracentrifugación del gradiente de densidad de iodixanol, primero agregue un tubo de ultra centrífuga de pared delgada de 0.5 mililitros de 40% de iodixanol a un tubo de ultra centrífuga de pared delgada de 13.2 mililitros. Luego prepare la columna con adiciones sucesivas de 2.5 mililitros de iodixanol al 20% y 2.5 mililitros de iodixanol al 10%. Antes de la ultracentrifugación, agregue cuidadosamente de seis a 6,5 mililitros de la solución de virus aludida desde el sistema TFF a la columna de iodixanol sin alterar el gradiente.
Después de la ultracentrifugación, retire los tubos con un par de pinzas estériles. La banda objetivo debe ser una banda grande entre los gradientes de 10 y 20%. A continuación, suspenda el tubo sobre la parte superior de un vaso de precipitados con un soporte de retorta.
Después de eso, conecte una aguja de 1.5 pulgadas de calibre 18 a una jeringa de cinco mililitros, luego perfore el costado del tubo de la ultracentrífuga con la aguja y retire la banda objetivo extendiendo lentamente el émbolo. Después de extraer el iodixanol de la solución del virus como se describe en el manuscrito, use una jeringa para inyectar cuidadosamente el virus en un casete de diálisis. Para concentrar la solución de virus, retire el cassette de diálisis del tampón de diálisis y colóquelo en una pequeña bolsa de plástico sellable.
Luego agregue de 15 a 25 mililitros de polietilenglicol al 40% a la bolsa para que el cassette de diálisis quede completamente sumergido. Después de la diálisis, enjuague brevemente el cassette de diálisis con PBS. A continuación, llene una jeringa equipada con una aguja de 1,5 pulgadas de calibre 18 con aire, inserte la jeringa en el cassette de diálisis y empuje el émbolo.
Gire el aparato para eliminar el virus sin eliminar el aire introducido. Para desalojar el virus residual que se adhiere a la membrana, masajee cuidadosamente la membrana con los dedos enguantados sin dañarla. Para facilitar el proceso de desalojo, retire parte del exceso de aire en el cassette de diálisis.
Para los ensayos de control de calidad, primero, diluya la solución del virus 100 veces agregando 10 microlitros a 990 microlitros de PBS en un tubo de 1.5 mililitros. Luego continúe la dilución en serie agregando 100 microlitros de la dilución anterior a 900 microlitros de PBS. Para los ensayos de infección, agregue 20 microlitros de cada ilusión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
Antes de examinar el efecto citopático de la proteína de fluorescencia verde, o realizar un ensayo de inmunofluorescencia indirecta, incube la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante al menos 48 horas. Mediante el uso de este protocolo, se obtuvo un NDV altamente purificado como lo demuestra la electroforesis en gel de poliacrilamida con sulfato de sodio de las proteínas virales. La infectividad del virus purificado por este método también se verificó mediante la dosis de infección de cultivo de tejidos del 50% o el ensayo TCID50 realizado en 96 placas de pozos.
El TCID50 se determinó a partir del número de pocillos positivos para cada dilución utilizando la calculadora Spearman-Karber. El ensayo de infección reveló la diferencia entre los efectos citopáticos del VEN lentogénico y mesogénico en células DF en diferentes condiciones después de 10 y 24 horas de incubación. El ensayo immuno florence también fue efectivo en el estudio de la infección de las células Vero por el VEN lentogénico.
Al preparar el sistema experimental, asegúrese de que las líneas estén cebadas de manera efectiva, ya que cualquier hidróxido de sodio residual inactivará el virus. También es importante mantener la integridad de la membrana, ya que comprometer esto afectará significativamente la purificación y el rendimiento del virus.
