Die Triphosphorylierung ist eine allgegenwärtige 5'-Modifikation von RNA in der Biologie und wird zunehmend in biotechnologischen Anwendungen eingesetzt. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die 5'Triphosphorylierung eines beliebigen Oligonukleotids, das durch automatisierte Standardsynthese hergestellt wird. Die chemische Triphosphorylierung funktioniert an Oligonukleotiden, die RNA, DNA oder nicht-natürliche Nukleinsäure enthalten.
Hier wird triphosphorylierte linkshändige L-RNA, das Enantiomer der biologischen D-RNA, gereinigt synthetisiert und in einer Ribosomenreaktion eingesetzt. Die Triphosphorylierung erfolgt nach automatisierter Oligonukleotidsynthese und vor Deprotektion. Diese Schritte werden hier nicht gezeigt, aber die Forscher sollten mit Standardmethoden für beide vertraut sein.
Stellen Sie zunächst sicher, dass der Arbeitsbereich für die Phosphorylierung über einen Gasverteiler mit mindestens zwei Leitungen und den Blasen verfügt, der mit einer trockenen Argonquelle mit einstellbarem Druck verbunden ist, da die Triphosphorylierungsreaktion unter Argon durchgeführt werden muss. Befestigen Sie dann eine Milliliter-Kunststoffspritze an den Leitungen, um den Anschluss an den Reaktionsapparat zu erleichtern. Als nächstes sammeln Sie die Ausrüstung einschließlich eines Milliliters Kunststoffspritzen, eines Drei-Wege-Polypropylen-Absperrhahns, nicht entkernenden Nadeln, 1,5-Milliliter-Polypropylenröhrchen, eines kleinen Metallspatels und lagern Sie sie in einem versiegelten Behälter oder Exsikkator mit einem Trockenmittel bei Raumtemperatur für mindestens einen Tag vor dem Gebrauch.
Unter Argondruck 30 Milliliter wasserfreies 1,4-Dioxan aus einer verschlossenen Flasche entnehmen. In eine getrocknete 30-Milliliter-Glasflasche geben und eine Trockenfalle hinzufügen. Mit Gummisepten versiegeln und in einem Exsikkator mit Trockenmittel aufbewahren.
In ähnlicher Weise bereiten Sie 30 Milliliter N, N-Dimethylformamid, Acetonitril und die Mischung aus drei Teilen Dioxan und einem Teil Pyridin nach Volumen vor. Bereiten Sie TBAP-Lösung vor, indem Sie festes Tributylammoniumpyrophosphat mit Dimethylformamid und Tributylamin in einer 30-Milliliter-Glasflasche mischen, wie im Manuskript beschrieben. Fügen Sie drei Zeichenfallen hinzu.
Verschließen Sie die Flasche mit einem Gummiseptum unter Argon und blasen Sie mit Argon für 30 Minuten. Nach der Herstellung eines Oligonukleotids mit einem freien 5'hydroxyl auf einer Synthesesäule mit einem automatisierten DNA/RNA-Synthesizer. Bereiten Sie die Kammer vor, indem Sie den Kolben aus einer trockenen Ein-Milliliter-Spritze entfernen.
Schneiden Sie die Oberseite der Spritze mit einer Schere oder einer Rasierklinge ab und befestigen Sie die Spritze an der Synthesesäule. Befestigen Sie den Drei-Wege-Absperrhahn an der Oberseite der Spritze und befestigen Sie den seitlichen Einlass des Absperrhahns mit dem Bubbler an der trockenen Argonquelle, so dass der obere Einlass des Absperrhahns als Reagenzieninjektionsanschluss fungiert. Befestigen Sie diese Bediener an einem Ständer mit Klemmen und dichten Sie alle vorgeschalteten Verbindungen mit Wachsdichtfolie ab.
Stellen Sie dann den Absperrhahn so ein, dass der Einspritzanschluss geschlossen ist und die Vorrichtung zur Argonquelle hin offen ist. Schließen Sie den Bubbler und lassen Sie Argon bei niedrigem Druck fünf Minuten lang durch die Aktionskammer strömen. Nachdem Sie den Bubbler wieder geöffnet haben, befestigen Sie eine Spritze an der Unterseite der Synthesesäule, bei der es sich um die Abfallspritze handelt.
Als nächstes ziehen Sie Argon wiederholt mit der Abfallspritze durch die Säule und befestigen Sie dann die Spritze wieder, wobei der Kolben vollständig eingedrückt ist. Um ein Reagenz oder Lösungsmittel hinzuzufügen, befestigen Sie eine Nadel an der trockenen Argonquelle und führen Sie sie in das Reagenz- oder Lösungsmittelflaschenseptum ein, wobei Sie darauf achten, dass die Nadel nicht in den Flascheninhalt eingetaucht wird. Setzen Sie dann eine Trockenspritze mit einer Nadel zusammen und führen Sie sie in das Reagenz- oder Lösungsmittelflaschenseptum ein, ohne sie in den Flascheninhalt zu tauchen.
Füllen Sie anschließend die Spritze mit Argon, ziehen Sie die Nadel aus dem Septum und stoßen Sie das Argon aus. Nachdem Sie die Spritze mit Argon gefüllt und noch einmal ausgestoßen haben, füllen Sie die Spritze mit dem erforderlichen Volumen an Lösungsmittel oder Reagenz unter Argondruck. Stellen Sie den Absperrhahn so ein, dass die Argonquelle geschlossen und der Einspritzanschluss geöffnet ist.
Sobald der Stopp am Gerät schnell eingestellt ist, entfernen Sie die gefüllte Spritze und die Nadel aus der Quellflasche, wischen Sie das Lösungsmittel ab, das an der Seite oder Spitze der Nadel haftet, und führen Sie die Nadel dann in den Injektionsanschluss ein. Nachdem ein Reagenz in die Antikammer der Bediener ausgestoßen wurde, entfernen Sie die Nadel und schließen Sie die Injektionsöffnung, während Sie das Gerät wieder für die Argonquelle öffnen. Ziehen Sie die Flüssigkeit vorsichtig aus der Antikammer durch die Synthesesäule mit der Abfallspritze, so dass die gesamte Flüssigkeit nun in der Abfallspritze gehalten wird.
Schieben Sie nun die Lösung langsam wieder in die Synthesesäule, um sicherzustellen, dass sich keine Gasblasen in der Säule befinden. Zum Mischen oder Rühren ziehen Sie die Lösung vorsichtig mit der Abfallspritze über die Säule auf und ab. Um ein Reagenz oder Lösungsmittel aus der Säule zu entfernen, ziehen Sie die Lösung langsam in die Abfallspritze.
Nachdem der Großteil der Lösung in die Abfallspritze gelangt ist, ziehen Sie Argon durch, um das verbleibende Lösungsmittel aus der Säule zu spülen. Als nächstes entfernen Sie die Wachsdichtungsfolie um die Abfallspritzenfuge. Entfernen Sie dann die Spritze und entsorgen Sie die Abfalllösung.
Ersetzen Sie anschließend die Abfallspritze durch eine neue Trockenspritze und verschließen Sie die Verbindung erneut. Nach dem Zusammenbau der Triphosphorylierungsvorrichtung beginnen Sie die Triphosphorylierungsreaktion, indem Sie 200 Mikroliter Pyridindioxan in die Antikammer geben, wie zuvor gezeigt. Aber ziehen Sie die Probe noch nicht auf die Synthesesäule.
Nachdem SalPCl wie im Manuskript beschrieben in Dioxan gelöst wurde, fügen Sie es der Antikammer hinzu und laden Sie es mit einer Trockenspritze auf die Synthesesäule. Lassen Sie es dann 15 Minuten lang reagieren und entfernen und entsorgen Sie dann die SalPCl-Lösung mit einer Abfallspritze, wie zuvor gezeigt. Unmittelbar nach dem Entfernen der SalPCl-Lösung 250 Mikroliter TBAP-Lösung in die Antikammer geben und auf die Synthesesäule laden.
Lassen Sie es 20 Minuten mit Rühren reagieren und verwerfen, wie zuvor beschrieben. Danach wurde die Säule mit 0,5 Millilitern N, N-Dimethylformamid, dann 0,5 Milliliter Acetonitril gewaschen und das Lösungsmittel nach jeder Zugabe entfernt. Nach Zugabe der Oxidationslösung, dem Entfernen und erneuten Waschen der Säule mit Acetonitril nach dem gleichen Verfahren zerlegen Sie die Apparatur und waschen die Säule mit fünf Millilitern Acetonitril.
Anschließend trocknen Sie die Säule. Spalten Sie das triphosphorylierte Oligonukleotid vom festen Träger und entfernen Sie den Schutz mit Standardprotokollen, wie im Manuskript beschrieben. Als nächstes das getrocknete ungeschützte Oligonukleotid in Harnstoff-Ladepuffer gelöst, auf 80 Grad Celsius erhitzt, dann auf ein Polyacrylamid-Gel geladen und ein bis zwei Stunden bei 25 bis 35 Watt laufen lassen.
Am Ende der Gelelektrophorese, nach dem Entfernen der Gelplatte, zerlegen Sie sie und wickeln Sie das Gel in Polyvinylchloridfolie. Als nächstes identifizieren Sie die Produktbänder durch Rückbeschattung mit 254 Nanometer UV-Licht und entfernen Sie das Hauptproduktband mit einer Rasierklinge. Zerkleinern Sie das ausgeschnittene Gel, indem Sie es durch eine Kunststoffspritze oder mechanisch extrudieren.
Bei Oligonukleotiden, die kürzer als 15 Nukleotide sind, im dreifachen Gelvolumen von nukleasefreiem Wasser für mindestens 12 Stunden mit Bewegung oder Schütteln eluieren. Entfernen Sie dann feste Gelstücke, indem Sie die Lösung durch eine Spritze führen, die mit einem 0,2-Mikrometer-Filter ausgestattet ist, und konzentrieren Sie sich durch Lyophilisation. Entfernen Sie nach der Konzentration Restsalze und Salutschüsse mit einer Einweg-Größenausschlusssäule und konzentrieren Sie sich durch Lyophilisation, wie zuvor gezeigt.
Nach der Herstellung von 10 Mikrolitern einer RNA-Lösung, die Polymerase-Ribozym und L-RNA-Primer-Schablone und Triphosphat-Trinukleotide enthält, wie im Manuskript beschrieben, wird es geglüht, indem es für eine Minute auf 90 Grad Celsius erhitzt und in einem PCR-Thermocycler auf 23 Grad Celsius bei 0,2 Grad Celsius pro Sekunde abgekühlt wird. Nachdem Sie die RNA-Lösung bei 17 Grad Celsius inkubiert haben, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 10 Mikroliter der doppelten Konzentration des Startpuffers hinzufügen, während die Reaktion fortschreitet, nehmen Sie 10 Mikroliter Aliquots und löschen Sie mit fünf Mikrolitern 0,5 molar EDTA bei pH 8 und verarbeiten Sie jede Probe, um RNA zu isolieren, wie im Manuskript beschrieben. Lösen Sie die ausgefällte RNA in 10 Mikrolitern formalisiertem Gelladepuffer auf und bereiten Sie den nicht umgesetzten endmarkierten Primer wie im Text beschrieben vor.
Sobald die Proben vorbereitet sind, auf 80 Grad Celsius erhitzen. Laden Sie fünf Mikroliter der Probe in jede Vertiefung und lassen Sie das Gel mit 40 Watt für ungefähr 40 Minuten laufen. Nachdem Sie die Gelplatte aus dem Ständer entfernt haben, scannen Sie mit einem fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Gelscanner, um kreuzchirale L-RNA-Extensionsprodukte zu visualisieren.
Nach der Gelreinigung zeigt die UV-Rückbeschattung das Vorhandensein von 5'Triphosphat als einzelnes Hauptprodukt, wie es für AAA- und CCC-DNA-Trimere und GAA L-RNA-Trimere gezeigt wurde. Das 5'hydroxyl-Nebenprodukt ist oft als langsamer wanderndes Band sichtbar, das isoliert und durch Massenspektrometrie für DNA-Trimer identifiziert wurde. Zusätzliche Banden während der Gelreinigung korrelieren mit 5'diphosphat, Monophosphat und H-phosphonat-Nebenprodukten in der Massenspektrometrie der ungereinigten Reaktionsprodukte.
5'Triphosphatprodukte zeigen einen primären Massenpeak, der dem 5'triphosphat zusammen mit 5'di und Monophosphatmassen entspricht. Chemisch triphosphatverwandte L-RNA-Trinukleotide wurden mit einem L-RNA-Primer und einer L-RNA-Vorlage in einer von PAGE analysierten und mit einem fluoreszierenden Gelscanner abgebildeten RNA-Polymerisationsreaktion verwendet. Das erweiterte Produkt, das durch schwarze Kreise markiert war, demonstrierte die Synthese einer L-RNA-Version des von der Vorlage kodierten Hammerkopf-Ribozyms.
Die Exposition gegenüber Wasser während der Triphosphorylierung verringert die Ausbeute. Befolgen Sie die Schritte zur Herstellung von Trockenreagenzien und zur sorgfältigen Montage des Reaktionsapparates. Bewegen Sie Flüssigkeiten langsam durch das Gerät, um einen Bruch der Dichtungen zu vermeiden.
Die chemische Triphosphorylierung ist für die Herstellung nicht-biologischer Oligonukleotidtriphosphate, einschließlich linkshändiger RNA, unerlässlich. Dies hat eine kreuzchirale Ribozymsynthese der spiegelbildlichen Versionen von RNA-Molekülen ermöglicht, die in der Biologie gefunden wurden.
