Triphosphorylation é uma onipresente modificação de 1,5'00 de RNA em biologia e é cada vez mais usada em aplicações de biotecnologia. O protocolo aqui descrito permite a triphosforilação de qualquer oligonucleotídeo preparado pela síntese automatizada padrão. A triphosforilação química trabalha em oligonucleotídeos contendo RNA, DNA ou ácido nucleico não natural.
Aqui, o L-RNA canhoto triphosforilado, o enantiomer do D-RNA biológico, é sintetizado purificado e usado em uma reação ribossa. A triphosforilação é realizada após síntese automatizada de oligonucleotídeos e antes da desproteção. Esses passos não são mostrados aqui, mas os pesquisadores devem estar familiarizados com métodos padrão para ambos.
Para começar, certifique-se de que o espaço de trabalho para a fosforilação tenha um coletor de gás com pelo menos duas linhas e o borbulhador conectado a uma fonte de argônio seco com pressão ajustável, pois a reação de triphosforilação deve ser realizada sob argônio. Em seguida, conecte uma seringa de plástico mililitro nas linhas para facilitar a conexão com o aparelho de reação. Em seguida, colete os equipamentos, incluindo uma seringa de plástico mililitro, uma torneira de polipropileno de três vias, agulhas não decorante, tubos de polipropileno de 1,5 mililitro, uma pequena espátula metálica, e armazene-os em um recipiente selado ou desiccador com um dissoceunte à temperatura ambiente por pelo menos um dia antes do uso.
Sob pressão de argônio, retire 30 mililitros de anidro 1, 4-dioxano de uma garrafa selada. Transfira para uma garrafa de vidro seca de 30 mililitros e adicione uma armadilha de secagem. Lacre com septa de borracha e armazene em um desiccador com dessicante.
Da mesma forma, prepare 30 mililitros de N, N-dimetilformamida, acetonitrilo, e a mistura de três partes de dioxano e uma parte piridina em volume. Prepare a solução TBAP misturando pirofosfato de tributylammonium sólido com dimetilformamida e tributilamina em uma garrafa de vidro de 30 mililitros como descrito no manuscrito. Adicione três armadilhas de desenho.
Sele a garrafa com um septo de borracha sob argônio e bolha com argônio por 30 minutos. Depois de preparar um oligonucleotídeo com um hidroxilo gratuito de 5'hydroxyl em uma coluna de síntese usando um sintetizador automatizado de DNA/RNA. Prepare a câmara removendo o êmbolo de uma seringa seca de um mililitro.
Corte a parte superior da seringa usando uma tesoura ou uma lâmina de barbear e conecte a seringa à coluna de síntese. Ao topo da seringa, conecte a torneira de três vias e conecte a entrada lateral da torneira à fonte seca de argônio com o borbulhante para que a entrada superior da torneira aja como a porta de injeção de reagente. Fixar este operador em um suporte com grampos e selar todas as juntas a montante com filme de selagem de cera.
Em seguida, ajuste a torneira para que a porta de injeção esteja fechada e o aparelho esteja aberto à fonte de argônio. Feche o borbulhante e deixe argônio em baixa pressão para fluir através da câmara de ação por cinco minutos. Após reabrir o borbulhante, conecte uma seringa ao fundo da coluna de síntese, que será a seringa de resíduos.
Em seguida, puxe argônio através da coluna repetidamente usando a seringa de resíduos e, em seguida, recoloque a seringa com o êmbolo empurrado totalmente para dentro. Para adicionar um reagente ou solvente, conecte uma agulha à fonte de argônio seco e insira-a no septo de garrafa de reagente ou solvente, tomando cuidado para não imergir a agulha no conteúdo da garrafa. Em seguida, monte uma seringa seca com uma agulha e insira-a no septo de garrafa de reagente ou solvente sem imergi-la no conteúdo da garrafa.
Depois, encha a seringa com argônio, retire a agulha do septo e expulse o argônio. Depois de encher a seringa com argônio e expelir mais uma vez, encha a seringa com o volume necessário de solvente ou reagente sob pressão de argônio. Ajuste a torneira para que a fonte de argônio esteja fechada e a porta de injeção esteja aberta.
Uma vez que a parada no aparelho seja ajustada rapidamente, remova a seringa e a agulha preenchidas da garrafa de origem, limpe qualquer solvente preso ao lado ou ponta da agulha e, em seguida, insira a agulha na porta de injeção. Após expulsar um reagente na anti-câmara dos operadores, remova a agulha e feche a porta de injeção enquanto reabri o aparelho à fonte de argônio. Retire suavemente o líquido da anti-câmara até a coluna de síntese usando a seringa de resíduos para que todo o líquido seja agora mantido na seringa de resíduos.
Agora, empurre lentamente a solução de volta para a coluna de síntese, garantindo que não haja bolhas de gás na coluna. Para misturar ou agitar, puxe suavemente a solução para cima e para baixo sobre a coluna com a seringa de resíduos. Para remover um reagente ou solvente da coluna, puxe lentamente a solução para dentro da seringa de resíduos.
Depois que a maior parte da solução passar para a seringa de resíduos, puxe argônio para lavar o solvente restante da coluna. Em seguida, remova o filme de selagem de cera em torno da junta de seringa de resíduos. Em seguida, remova a seringa e descarte a solução de resíduos.
Depois, substitua a seringa de resíduos por uma nova seringa seca e resseque a articulação. Depois de montar o aparelho de triphosforilação, comece a reação de triphosforilação adicionando 200 microliters de dioxano piridina à anti-câmara, como demonstrado anteriormente. Mas não puxe a amostra para a coluna de síntese ainda.
Depois de dissolver SalPCl em dioxano como descrito no manuscrito, adicione-o à anti-câmara e carregado na coluna de síntese usando uma seringa seca. Em seguida, deixe-o reagir por 15 minutos e, em seguida, remova e descarte a solução SalPCl usando uma seringa de resíduos como demonstrado anteriormente. Imediatamente após a remoção da solução SalPCl, adicione 250 microliters de solução TBAP à anti-câmara e carregado na coluna de síntese.
Que reaja 20 minutos com agitação e descarte como descrito anteriormente. Depois, lavei a coluna com 0,5 mililitros de N, N-dimetilformamida, depois 0,5 mililitros de acetonitrilo, removendo o solvente após cada adição. Depois de adicionar solução oxidante, removê-la e lavar a coluna com acetonitrila novamente usando o mesmo procedimento mostrado, desmonte o aparelho e lave a coluna com cinco mililitros de acetonitrila.
Depois, seque a coluna. Cortar o oligonucleotídeo triphosforilado do suporte sólido e desprotegir usando protocolos padrão como descrito no manuscrito. Em seguida, dissolveu o oligonucleotídeo desprotegido seco no tampão de carga da ureia, aquecido a 80 graus Celsius, depois carregou em um gel de poliacrilamida e correr por uma a duas horas a 25 a 35 watts.
No final da eletroforese do gel, depois de remover a placa de gel, desmonte-a e enrole o gel em filme de polivinylchloreto. Em seguida, identifique as bandas do produto com sombra traseira com 254 nanômetros de luz UV e extirpa a banda principal do produto usando uma lâmina de barbear. Esmague o gel excisado extrudando-o através de uma seringa plástica ou mecanicamente.
Para oligonucleotídeos menores que 15 nucleotídeos, elute em três vezes o volume de gel de água livre nuclease por pelo menos 12 horas com agitação ou agitação. Em seguida, remova as peças de gel sólido passando a solução através de uma seringa equipada com um filtro de 0,2 micrômetro e concentre-se por liofilização. Após a concentração, remova sais residuais e saudações usando uma coluna de exclusão de tamanho descartável e concentre-se por liofilização, como demonstrado anteriormente.
Depois de preparar 10 microlitrais de uma solução RNA contendo modelo de ribozyme de polimerase e modelo de primer L-RNA e trinucleotídeos triptosfatos como descrito no manuscrito, anneal-lo aquecendo-o a 90 graus Celsius por um minuto e esfriando-o a 23 graus Celsius a 0,2 graus Celsius por segundo em um termorCrcicr PCR. Depois de incubar a solução de RNA a 17 graus Celsius, pare a reação adicionando 10 microlitadores de duas vezes a concentração do buffer inicial à medida que a reação prossegue, pegue 10 alíquotas de microliter e sacie com cinco microlitradores de 0,5 molar EDTA no pH 8 e processe cada amostra para isolar RNA como descrito no manuscrito. Dissolva o RNA precipitado em 10 microliters de amortecedor formalizado de carregamento de gel e prepare o primer end não redigido como descrito no texto.
Uma vez que as amostras são preparadas, aqueça a 80 graus Celsius. Carregue cinco microliters da amostra em cada poço e execute o gel a 40 watts por aproximadamente 40 minutos. Depois de remover a placa de gel do suporte, escaneie usando um scanner de gel fluorescente ou fosforescente para visualizar produtos de extensão L-RNA quiral.
Após a purificação do gel, a sombra traseira UV revela a presença de 5'triphosphate como um único produto importante, como mostrado para aAA e CCC dna trimers e gaa L-rna trimer. O produto lateral de 5'hidroxyl é frequentemente visível como uma banda migratória mais lenta, que foi isolada e identificada pela espectrometria de massa para aparadores de DNA. Bandas adicionais durante a purificação de gel se correlacionam com produtos laterais de 5'diphosphate, monofosfato e h-fosfosfonato na espectrometria de massa dos produtos de reação não purificados.
Os produtos triphosfato de 5'triphosfato apresentam um pico de massa primária correspondente ao triphosfato de 5'triphosfato, juntamente com massas de 5'di e monofosfato. Trinucleotídeos L-RNA relacionados quimicamente triptosfato foram usados com um primer L-RNA e modelo L-RNA em uma reação de polimerização de RNA analisada pela PAGE e imaged usando um scanner de gel fluorescente. O produto estendido marcado por círculos pretos demonstrou a síntese de uma versão L-RNA da enzima de ribozyme hammerhead codificada pelo modelo.
A exposição à água durante a triphosforilação reduzirá o rendimento. Siga os passos para preparar reagentes secos e montar cuidadosamente o aparelho de reação. Mova fluidos através do aparelho lentamente para evitar quebrar as vedações.
A triptosforilação química é essencial para preparar triphosfatos de oligonucleotídeos não biológicos, incluindo RNA canhoto. Isso permitiu a síntese de ribozyme quiral cruzado das versões de imagem espelhada das moléculas de RNA encontradas na biologia.
