La trifosforilación es una modificación ubicua de 5'del ARN en biología y se utiliza cada vez más en aplicaciones biotecnológicas. El protocolo descrito aquí permite la 5'trifosforilación de cualquier oligonucleótido preparado por síntesis automatizada estándar. La trifosforilación química funciona en oligonucleótidos que contienen ARN, ADN o ácido nucleico no natural.
Aquí, el L-ARN zurdo trifosforilado, el enantiómero del D-ARN biológico, se sintetiza purificado y se utiliza en una reacción de ribosoma. La trifosforilación se realiza después de la síntesis automatizada de oligonucleótidos y antes de la desprotección. Estos pasos no se muestran aquí, pero los investigadores deben estar familiarizados con los métodos estándar para ambos.
Para comenzar, asegúrese de que el espacio de trabajo para la fosforilación tenga un colector de gas con al menos dos líneas y el burbujeador conectado a una fuente de argón seco con presión ajustable, ya que la reacción de trifosforilación debe realizarse bajo argón. Luego conecte jeringas de plástico de un mililitro a las líneas para facilitar la conexión al aparato de reacción. A continuación, recoja el equipo, incluidas jeringas de plástico de un mililitro, una llave de paso de polipropileno de tres vías, agujas no punteras, tubos de polipropileno de 1,5 mililitros, una pequeña espátula de metal, y guárdelos en un recipiente sellado o desecador con un desecante a temperatura ambiente durante al menos un día antes de su uso.
Bajo presión de argón, retire 30 mililitros de 1, 4-dioxano anhidro de una botella sellada. Transfiera a una botella de vidrio seca de 30 mililitros y agregue una trampa de secado. Selle con septos de goma y guárdelo en un desecador con desecante.
Del mismo modo, prepare 30 mililitros de N, N-dimetilformamida, acetonitrilo y la mezcla de tres partes de dioxano y una parte de piridina por volumen. Prepare la solución de TBAP mezclando pirofosfato de tributilamonio sólido con dimetilformamida y tributilamina en una botella de vidrio de 30 mililitros como se describe en el manuscrito. Agregue tres capturas de dibujo.
Selle la botella con un tabique de goma bajo argón y burbujee con argón durante 30 minutos. Después de preparar un oligonucleótido con un 5'hidroxilo libre en una columna de síntesis utilizando un sintetizador automatizado de ADN/ARN. Prepare la cámara retirando el émbolo de una jeringa seca de un mililitro.
Corte la parte superior de la jeringa con unas tijeras o una cuchilla de afeitar y conecte la jeringa a la columna de síntesis. En la parte superior de la jeringa, conecte la llave de paso de tres vías y conecte la entrada lateral de la llave de paso a la fuente de argón seco con el burbujeador para que la entrada superior de la llave de paso actúe como el puerto de inyección de reactivo. Asegure estos operadores a un soporte con abrazaderas y selle todas las juntas aguas arriba con una película de sellado de cera.
Luego ajuste la llave de paso para que el puerto de inyección esté cerrado y el aparato esté abierto a la fuente de argón. Cierre el burbujeador y deje que el argón a baja presión fluya a través de la cámara de acción durante cinco minutos. Después de volver a abrir el burbujeador, coloque una jeringa en la parte inferior de la columna de síntesis, que será la jeringa de desecho.
A continuación, tire del argón a través de la columna repetidamente usando la jeringa de desecho y luego vuelva a conectar la jeringa con el émbolo completamente empujado. Para agregar un reactivo o disolvente, conecte una aguja a la fuente de argón seco e insértela en el reactivo o en el tabique de la botella de disolvente, teniendo cuidado de no sumergir la aguja en el contenido de la botella. Luego, ensamble una jeringa seca con una aguja e insértela en el tabique del reactivo o del frasco de solvente sin sumergirlo en el contenido del frasco.
Después, llene la jeringa con argón, retire la aguja del tabique y expulse el argón. Después de llenar la jeringa con argón y expulsar una vez más, llene la jeringa con el volumen requerido de disolvente o reactivo bajo presión de argón. Ajuste la llave de paso para que la fuente de argón esté cerrada y el puerto de inyección esté abierto.
Una vez que la parada en el aparato se ajuste rápidamente, retire la jeringa llena y la aguja del frasco de origen, limpie cualquier disolvente pegado al costado o la punta de la aguja y luego inserte la aguja en el puerto de inyección. Después de expulsar un reactivo a la anticámara de los operadores, retire la aguja y cierre el puerto de inyección mientras vuelve a abrir el aparato a la fuente de argón. Extraiga suavemente el líquido de la anticámara a través de la columna de síntesis utilizando la jeringa de desecho para que todo el líquido ahora se mantenga en la jeringa de desecho.
Ahora empuje lentamente la solución hacia arriba en la columna de síntesis, asegurándose de que no haya burbujas de gas en la columna. Para mezclar o agitar, tire suavemente de la solución hacia arriba y hacia abajo sobre la columna con la jeringa de desecho. Para eliminar un reactivo o disolvente de la columna, tire lentamente de la solución hacia la jeringa de desecho.
Después de que la mayor parte de la solución haya pasado a la jeringa de desecho, tire del argón para eliminar el disolvente restante de la columna. A continuación, retire la película de sellado de cera alrededor de la junta de la jeringa de desecho. A continuación, retire la jeringa y deseche la solución de desecho.
Después, reemplace la jeringa de desecho con una jeringa seca nueva y vuelva a sellar la articulación. Después de ensamblar el aparato de trifosforilación, comience la reacción de trifosforilación agregando 200 microlitros de piridina dioxano a la anticámara como se demostró anteriormente. Pero no tire de la muestra a la columna de síntesis todavía.
Después de disolver SalPCl en dioxano como se describe en el manuscrito, agréguelo a la anticámara y cárguelo en la columna de síntesis con una jeringa seca. Luego deje que reaccione durante 15 minutos y luego retire y deseche la solución de SalPCl con una jeringa de desecho como se demostró anteriormente. Inmediatamente después de retirar la solución de SalPCl, agregue 250 microlitros de solución TBAP a la anticámara y cárguelos en la columna de síntesis.
Deja que reaccione 20 minutos con agitación y desecha como se describió anteriormente. Posteriormente, lave la columna con 0,5 mililitros de N, N-dimetilformamida, luego 0,5 mililitros de acetonitrilo, retirando el disolvente después de cada adición. Después de agregar la solución oxidante, retirarla y lavar la columna con acetonitrilo nuevamente utilizando el mismo procedimiento mostrado, desmonte el aparato y lave la columna con cinco mililitros de acetonitrilo.
Después, seca la columna. Separar el oligonucleótido trifosforilado del soporte sólido y desproteger utilizando protocolos estándar como se describe en el manuscrito. A continuación, disuelva el oligonucleótido seco desprotegido en un tampón de carga de urea, se caliente a 80 grados centígrados, luego se cargue en un gel de poliacrilamida y se ejecute durante una o dos horas a 25 a 35 vatios.
Al final de la electroforesis en gel, después de quitar la placa de gel, desensémbela y envuelva el gel en una película de cloruro de polivinilo. A continuación, identifique las bandas del producto mediante la sombra posterior con luz UV de 254 nanómetros e elimine la banda principal del producto con una cuchilla de afeitar. Triture el gel extirpado extruyéndolo a través de una jeringa de plástico o mecánicamente.
Para oligonucleótidos inferiores a 15 nucleótidos, eluya en tres veces el volumen de gel de agua libre de nucleasa durante al menos 12 horas con agitación o agitación. Luego retire las piezas de gel sólido pasando la solución a través de una jeringa equipada con un filtro de 0,2 micrómetros y concéntrese por liofilización. Después de la concentración, elimine las sales residuales y los saludos utilizando una columna de exclusión de tamaño desechable y concéntrese por liofilización como se demostró anteriormente.
Después de preparar 10 microlitros de una solución de ARN que contiene ribozima polimerasa y plantilla de imprimación de ARN-L y trinucleótidos de trifosfato como se describe en el manuscrito, recocirla calentándola a 90 grados Celsius durante un minuto y enfriándola a 23 grados Celsius a 0.2 grados Celsius por segundo en un termociclador pcR. Después de incubar la solución de ARN a 17 grados centígrados, detenga la reacción agregando 10 microlitros del doble de la concentración del tampón de inicio a medida que avanza la reacción, tome 10 alícuotas de microlitros y apague con cinco microlitros de EDTA molar de 0.5 a pH 8 y procese cada muestra para aislar el ARN como se describe en el manuscrito. Disuelva el ARN precipitado en 10 microlitros de tampón de carga de gel formalizado y prepare un cebador etiquetado final sin reaccionar como se describe en el texto.
Una vez preparadas las muestras, calienta a 80 grados centígrados. Cargue cinco microlitros de la muestra en cada pozo y haga funcionar el gel a 40 vatios durante aproximadamente 40 minutos. Después de retirar la placa de gel del soporte, escanee con un escáner de gel fluorescente o fosforescente para visualizar los productos de extensión de L-ARN quiral cruzado.
Después de la purificación en gel, el sombreado UV revela la presencia de 5'trifosfato como un solo producto principal como se muestra para los trímeros de ADN AAA y CCC y el trímero de ARN L-RNA GAA. El producto del lado 5'hidroxilo a menudo es visible como una banda de migración más lenta, que fue aislada e identificada por espectrometría de masas para trímeros de ADN. Las bandas adicionales durante la purificación del gel se correlacionan con los productos secundarios de 5'difosfato, monofosfato y H-fosfonato en espectrometría de masas de los productos de reacción no purificados.
Los productos de 5'trifosfato muestran un pico de masa primaria correspondiente al 5'trifosfato junto con masas de 5'di y monofosfato. Los trinucleótidos de ARN L relacionados químicamente con el trifosfato se utilizaron con un cebador de L-ARN y una plantilla de L-ARN en una reacción de polimerización de ARN analizada por PAGE y fotografiada utilizando un escáner de gel fluorescente. El producto extendido marcado por círculos negros demostró la síntesis de una versión L-RNA de la ribozima hammerhead codificada por la plantilla.
La exposición al agua durante la trifosforilación reducirá el rendimiento. Siga los pasos para preparar reactivos secos y ensamblar el aparato de reacción cuidadosamente. Mueva los fluidos a través del aparato lentamente para evitar la rotura de los sellos.
La trifosforilación química es esencial para preparar trifosfatos de oligonucleótidos no biológicos, incluido el ARN zurdo. Esto ha permitido la síntesis cruzada de ribozimas quirales de las versiones de imagen especular de las moléculas de ARN que se encuentran en la biología.
