البروتوكول حساس للغاية ويسمح بالتقاط إنتاجية عالية لملف تعريف التعبير الجيني بدقة خلية واحدة. توفر هذه التقنية كلا من الخصوصية المكانية التشريحية والجزيئية بدقة خلية واحدة. بعد حصاد الدماغ ، واختيار الخلايا المفردة ، وإعداد mRNA ، قم بحقن سائل خط التحكم في شريحة qPCR للتحضير.
أدخل شريحة qPCR في جهاز خلط الموائع الدقيقة. حدد البرنامج النصي Prime وقم بتشغيل البرنامج. بعد الانتهاء من البرنامج ، قم بإزالة رقاقة qPCR المعدة والماصة ستة ميكرولتر من التفاعل من لوحة عينة PCR إلى العينة المقابلة جيدا في شريحة qPCR المجهزة.
الآن ، ماصة ستة ميكرولتر من التفاعل من لوحة فحص PCR في بئر الفحص المقابل في رقاقة qPCR المجهزة. ثم أدخل الشريحة في جهاز خلط الموائع الدقيقة. حدد البرنامج النصي Load Mix وقم بتشغيل البرنامج.
قم بتشغيل منصة RT-qPCR الموائع الدقيقة وقم بتسخين المصباح. قم بإزالة شريحة qPCR من جهاز خلط الموائع الدقيقة وقشر الملصق الواقي من أسفل الشريحة. افتح منصة RT-qPCR الموائع الدقيقة وقم بتحميل شريحة qPCR في النظام الأساسي.
قم بتشغيل برنامج جمع البيانات بالنقر فوق بدء تشغيل جديد. تحقق من الرمز الشريطي للرقاقة ونوع الشريحة. ثم انقر فوق التالي.
حدد ملف تشغيل الشريحة وتصفح موقع الملف لتخزين جمع البيانات. ثم انقر فوق نوع التطبيق وحدد التعبير الجيني. حدد ROX للحصول على مرجع سلبي ، ومسبار واحد ، و EVAGreen لنوع المسبار.
انقر لتحديد برنامج الدراجات الحرارية وحدد Biomark HD GE: Fast 96x96 PCR + Melt v2. ملف PCL. قم بتنزيل برنامج تحليل البيانات.
قم بتشغيل البرنامج لتحليل تجربة الموائع الدقيقة RT-qPCR. انقر فوق تشغيل الشريحة وافتح ChipRun. BML الذي تم إنشاؤه بواسطة المجرب.
ستظهر نافذة تعرض التفاصيل التجريبية بما في ذلك المرجع السلبي والمسبار والبرنامج الحراري PCR. ضمن علامة التبويب مستكشف الرقاقة ، انقر فوق نموذج إعداد اللوحة وأنشئ نموذجا جديدا للوحة القالب. انسخ والصق نماذج الملصقات في جدول بيانات البرنامج وفقا للتصميم التجريبي.
أدخل اسم العينة وتركيز الحمض النووي الريبي المستخدم للعينات القياسية. الآن ، قم بتعيين العينة التي تم إعدادها بالنقر فوق خريطة من قائمة المهام وتحديد SBS96-Left.dsp. بعد ذلك ، حدد طرق عرض التفاصيل لتحديث هذه التغييرات في الملف وانقر فوق تحليل.
حدد إعداد لوحة الكاشف وقم بإنشاء لوحة فحص جديدة. حدد نوع الحاوية وتنسيقها المناسبين. الصق أسماء الفحص حسب التصميم التجريبي وانقر فوق تحليل.
في جزء إعدادات التحليل، انقر فوق المستخدم وقم بتعيين الملاءمة إلى تلقائي. الآن ، راجع يدويا كل تفاعل في شريحة 96x96. تصور منحنيات التضخيم والذوبان لتحديد ما إذا كان كل تفاعل يتبع نمط qPCR المتوقع.
إذا كان منحنى التضخيم أو الذوبان لا يتطابق مع ما هو متوقع ، ففشل هذا التفاعل. بعد مراقبة الجودة ، قم بتصدير البيانات عن طريق تحديد ملف ، والنقر فوق تصدير ، وحفظ مجموعة البيانات كملف csv. نظرا لأن ملف csv الذي تم تصديره يحتوي على مصفوفة فشل تمرير ومصفوفة بقيم CT أولية ، استخدم مصفوفة فشل التمرير لاستبدال أي خلايا فاشلة في مجموعة البيانات ب NA. قم بتنزيل الإصدار الأخير من برنامج R مفتوح المصدر ثم قم بتنزيل تطبيق R Studio.
بالنسبة للتمركز الوسيط ، استخدم برنامج R لحساب متوسط قيمة التصوير المقطعي المحوسب المحسوبة من جميع قيم التصوير المقطعي المحوسب لعينة فردية ثم اطرح جميع قيم التصوير المقطعي المحوسب الفردية من هذه القيمة المتوسطة للحصول على قيمة ناقص دلتا سي تي. لتطبيع جين التدبير المنزلي ، احسب متوسط التعبير عن جينات التدبير المنزلي لكل عينة واستخدم هذه القيمة لطرح قيم التصوير المقطعي المحوسب الفردية. لإنشاء قيمة ناقص دلتا دلتا CT ، قم بتشغيل التعليمات البرمجية في برنامج R.
قم بتحميل مجموعة البيانات التي تمت تسويتها إلى R وقم بتحليل البيانات باستخدام وظيفة المقياس ، وقم بإنشاء البيانات المقاسة ، ثم استخدم وظيفة خريطة الحرارة R أو برنامج منفصل لإنشاء خريطة حرارية. لتنظيم مجموعة البيانات للوظائف الأخرى ، احسب ارتباطات بيرسون بين كل جين متبوعا بوظيفة الذوبان. تصدير وتحميل هذه البيانات إلى برنامج شبكة الارتباط الجيني.
أظهرت الخلايا العصبية تعبيرا مرتفعا عن NeuN وأظهرت عينات الخلايا الدبقية الصغيرة تعبيرا كبيرا عن علامات الخلايا الدبقية الصغيرة Cd34 و Cx3xr1. أظهرت عينات Th + العصبية تعبيرا مرتفعا بشكل ملحوظ عن Th مقارنة بعينات Th-neuronal والخلايا الدبقية الصغيرة. أظهرت الخلايا العصبية Th-neurons تعبيرا مهما عن Gcg ، مما يشير إلى أن عينات Th-neuronal غنية بالخلايا العصبية التي تستخدم Glp1 كناقل عصبي.
أظهر التحليل التمييزي الخطي أن هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا لها ملفات تعريف تعبير جيني مختلفة عبر جميع الجينات ال 65. تم تمثيل الأنماط الظاهرية الفرعية الخلوية لعينات الخلايا العصبية المخصبة Glp1 من خلال سلسلة زمنية لانسحاب الكحول باستخدام خرائط الحرارة. يزداد النمط الظاهري الفرعي A ، الذي يعبر بشكل كبير عن مجموعة الجينات الالتهابية الأولى ، في النسبة عند نقطة وقت الانسحاب لمدة ثماني ساعات ويصل إلى الحد الأقصى عند الانسحاب لمدة 32 ساعة.
يتم تطبيع النمط الظاهري الفرعي الالتهابي للسيطرة عليه عن طريق الانسحاب لمدة 176 ساعة. يوضح النمط الظاهري الفرعي B ، الذي يعبر بشكل كبير عن المجموعة الجينية الثانية لمستقبلات GABA ، قمعا شاملا في التعبير عن مجموعة الجينات هذه من خلال حالة الانسحاب لمدة 176 ساعة. تم دمج التعبير الجيني للعينات الفردية في متوسطات بحيث يمكن تصور التعبير عن مجموعات الجينات وموقع البروتين لنسخة الجين هذه طوال السلسلة الزمنية.
يمكن تطبيق هذه التقنية على أي نظام بيولوجي أو نسيج لفهم الاستجابة الخلوية لمرض أو اضطراب. وذلك لفك تشفير الاستجابة الجزيئية بدقة خلية واحدة تتعلق بالبنية المكانية والتشريحية للنسيج.
