このプロトコルは高感度で、シングルセル分解能での遺伝子発現プロファイルのハイスループットキャプチャを可能にします。この技術は、単一細胞分解能で解剖学的空間的特異性と分子特異性の両方を提供します。脳を採取し、単一細胞を選択し、mRNAを調製した後、プライミングのためにコントロールライン液をqPCRチップに注入します。
qPCRチップをマイクロ流体混合装置に挿入します。Primeスクリプトを選択し、プログラムを実行します。プログラムが完了したら、プライミングされたqPCRチップを取り出し、6マイクロリットルの反応をPCRサンプルプレートからプライミングされたqPCRチップの対応するサンプルウェルにピペットで入れます。
次に、6マイクロリットルの反応物をPCRアッセイプレートからプライミングされたqPCRチップ内の対応するアッセイウェルにピペットで入れます。次に、チップをマイクロ流体混合装置に挿入します。Load Mix スクリプトを選択し、プログラムを実行します。
マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームの電源を入れ、電球を温めます。マイクロ流体混合装置からqPCRチップを取り外し、チップの下部から保護ステッカーをはがします。マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームを開き、qPCRチップをプラットフォームにロードします。
[新しい実行の開始]をクリックして、データ収集ソフトウェアを起動します。チップのバーコードとチップの種類を確認します。次に、[次へ]をクリックします。
チップ実行ファイルを選択し、データ収集ストレージのファイルの場所を参照します。次に、[アプリケーションタイプ]をクリックして、[遺伝子発現]を選択します。パッシブリファレンス、シングルプローブにはROXを、プローブタイプにはEVAGreenを選択します。
クリックして熱サイクルプログラムを選択し、Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2を選択します。PCL ファイルにエクスポートします。データ分析ソフトウェアをダウンロードします。
ソフトウェアを起動して、マイクロ流体RT-qPCR実験を分析します。[チップラン]をクリックして、チップランを開きます。実験ツールによって作成された BML ファイル。
パッシブリファレンス、プローブ、PCRサーマルプログラムなどの実験の詳細を表示するウィンドウがポップアップ表示されます。[チップ エクスプローラ]タブで、[サンプル プレート設定]をクリックし、新しいサンプル プレート テンプレートを作成します。サンプルラベルをコピーして、実験計画に従ってソフトウェアスプレッドシートに貼り付けます。
サンプル名と標準サンプルに使用するRNA濃度を入力します。次に、タスク メニューから [マップ] をクリックし、[SBS96-Left.dsp] を選択して、サンプル セットアップをマップします。次に、[詳細ビュー]を選択してファイル内のこれらの変更を更新し、[分析]をクリックします。
検出器プレートのセットアップを選択し、新しいアッセイプレートを作成します。適切なコンテナーの種類と形式を選択します。実験デザインに従ってアッセイ名を貼り付け、分析をクリックします。
分析設定ペインで、ユーザーをクリックし、フィットを自動に設定します。次に、96x96チップの各反応を手動で確認します。増幅曲線と融解曲線を視覚化して、各反応が予想されるqPCRパターンに従っているかどうかを判断します。
増幅曲線または融解曲線が予想と一致しない場合は、その反応に失敗します。QCに続いて、ファイルを選択し、[エクスポート]をクリックしてデータをエクスポートし、データセットをcsvファイルとして保存します。エクスポートされた csv ファイルには、パス フェイル マトリックスと生の CT 値を持つマトリックスの両方が含まれているため、パス フェイル マトリックスを使用して、データセット内の失敗したセルを NA に置き換えます。オープンソースRソフトウェアの最新バージョンをダウンロードしてから、R Studioアプリケーションをダウンロードします。
中央値のセンタリングでは、Rソフトウェアを使用して、個々のサンプルのすべてのCT値から計算されたCT値の中央値を計算し、この中央値からすべての個々のCT値を減算して、マイナスデルタCT値を取得します。ハウスキーピング遺伝子の正規化では、各サンプルのハウスキーピング遺伝子の平均発現を計算し、この値を使用して個々のCT値を差し引きます。マイナスのデルタデルタCT値を生成するには、Rソフトウェアでコードを実行します。
正規化されたデータセットを R にアップロードし、スケール関数を使用してデータを分析し、スケーリングされたデータを生成してから、R ヒート マップ関数または別のソフトウェアを使用してヒート マップを生成します。他の機能のためにデータセットを整理するには、各遺伝子間のピアソン相関を計算し、続いてmelt関数を計算します。このデータをエクスポートし、遺伝子相関ネットワークソフトウェアにアップロードします。
ニューロンはNeuNの発現上昇を示し、ミクログリアサンプルはミクログリアマーカーCd34およびCx3xr1の有意な発現を示した。Th+ニューロンサンプルは、Thニューロンおよびミクログリアサンプルと比較して、Thの発現が有意に上昇したことを示しました。ThニューロンはGcgの有意な発現を示し、Thニューロンサンプルが神経伝達物質としてGlp1を使用するニューロンで濃縮されていることを示唆しています。
線形識別分析は、これら3つの細胞タイプが65遺伝子すべてにわたって異なる遺伝子発現プロファイルを有することを示した。アルコール離脱時系列によるGlp1濃縮ニューロンサンプルの細胞サブ表現型をヒートマップを用いて表した。炎症性遺伝子クラスター1を高度に発現するサブ表現型Aは、8時間の離脱時点で比率が増加し、32時間の離脱で最大に達する。
炎症性サブ表現型は、176時間の離脱によって制御するように正規化される。GABA受容体遺伝子クラスター2を高発現するサブ表現型Bは、176時間の離脱条件によるこの遺伝子クラスターの発現の全体的な抑制を示す。個々のサンプルの遺伝子発現を平均に組み合わせて、遺伝子クラスターの発現とその遺伝子転写産物のタンパク質位置を時系列全体で視覚化できるようにしました。
この技術は、疾患または摂動に対する細胞応答を理解するために、任意の生物学的システムまたは組織に適用することができる。それは、組織の空間的および解剖学的構造に関連する単一細胞分解能での分子応答を解読することです。
