Протокол является высокочувствительным и позволяет захватывать профиль экспрессии генов с высокой пропускной способностью при разрешении одной клетки. Методика обеспечивает как анатомическую пространственную, так и молекулярную специфичность при разрешении одной клетки. После сбора мозга, отбора одиночных клеток и подготовки мРНК, введите жидкость контрольной линии в чип qPCR для прайминга.
Вставьте чип qPCR в микрофлюидное микшерное устройство. Выберите сценарий Prime и запустите программу. После завершения программы извлеките загрунтованный чип qPCR и пипетку шесть микролитров реакции из пластины образца ПЦР в соответствующую пробную скважину в загрунтованной микросхеме qPCR.
Теперь пипетка шесть микролитров реакции из пробирной пластины ПЦР в соответствующую пробирную скважину в загрунтованном чипе qPCR. Затем вставьте чип в микрофлюидное смесительное устройство. Выберите сценарий Load Mix и запустите программу.
Включите микрофлюидную платформу RT-qPCR и разогрейте лампочку. Извлеките чип qPCR из микрофлюидного смесительного устройства и снимите защитную наклейку с нижней части чипа. Откройте микрофлюидную платформу RT-qPCR и загрузите чип qPCR в платформу.
Запустите программное обеспечение для сбора данных, щелкнув Начать новый запуск. Проверьте штрих-код чипа и тип чипа. Затем нажмите «Далее».
Выберите файл запуска чипа и просмотрите расположение файла для хранилища сбора данных. Затем нажмите «Тип приложения» и выберите «Экспрессия генов». Выберите ROX для пассивного эталона, один зонд и EVAGreen для типа зонда.
Нажмите, чтобы выбрать программу термоциклирования и выбрать Biomark HD GE: Fast 96x96 PCR + Melt v2. pcl файл. Загрузите программное обеспечение для анализа данных.
Запустите программное обеспечение для анализа микрофлюидного эксперимента RT-qPCR. Щелкните Запуск чипа и откройте ChipRun. bml-файл, созданный экспериментатором.
Появится окно, отображающее экспериментальные детали, включая пассивный эталон, зонд и тепловизионную программу ПЦР. На вкладке Обозреватель микросхем щелкните Настройка образца пластины и создайте новый образец шаблона пластины. Скопируйте и вставьте образцы этикеток в электронную таблицу программного обеспечения в соответствии с экспериментальным дизайном.
Введите название образца и концентрацию РНК, используемую для стандартных образцов. Теперь сопоставьте пример настройки, щелкнув карта в меню задач и выбрав SBS96-Left.dsp. Затем выберите Представления сведений, чтобы обновить эти изменения в файле, и нажмите кнопку Анализ.
Выберите Настройка детекторной пластины и создайте новую пробирную пластину. Выберите соответствующий тип и формат контейнера. Вставьте имена анализов в соответствии с экспериментальным дизайном и нажмите «Анализировать».
В области параметров анализа щелкните Пользователь и установите для параметра Подгонка значение авто. Теперь вручную просмотрите каждую реакцию в чипе 96x96. Визуализируйте кривые усиления и расплава, чтобы определить, следовала ли каждая реакция ожидаемой схеме qPCR.
Если кривая усиления или расплава не совпадает с ожидаемой, провалите эту реакцию. Следуя контролю качества, экспортируйте данные, выбрав файл, щелкнув экспорт и сохранив набор данных в виде CSV-файла. Поскольку экспортированный CSV-файл имеет как матрицу сбоя передачи, так и матрицу с необработанными значениями CT, используйте матрицу сбоя прохода, чтобы заменить все неисправные ячейки в наборе данных NA. Загрузите последнюю версию программного обеспечения R с открытым исходным кодом, а затем загрузите приложение R Studio.
Для медианного центрирования используйте программное обеспечение R для расчета медианного значения КТ, рассчитанного из всех значений КТ для отдельного образца, а затем вычтите все отдельные значения КТ из этого медианного значения, чтобы получить значение минус дельта КТ. Для нормализации генов домашнего хозяйства рассчитайте среднюю экспрессию генов ведения домашнего хозяйства для каждого образца и используйте это значение для вычитания отдельных значений КТ. Чтобы сгенерировать значение КТ с пониженной дельта-дельтой, запустите код в программном обеспечении R.
Загрузите нормализованный набор данных в R и проанализируйте данные с помощью функции масштабирования, сгенерируйте масштабированные данные, а затем используйте функцию тепловой карты R или отдельное программное обеспечение для создания тепловой карты. Чтобы организовать набор данных для других функций, рассчитайте корреляции Пирсона между каждым геном, за которыми следует функция расплава. Экспортируйте и загрузите эти данные в программное обеспечение сети корреляции генов.
Нейроны показали повышенную экспрессию NeuN, а образцы микроглии показали значительную экспрессию микроглиальных маркеров Cd34 и Cx3xr1. Образцы Th+нейронов продемонстрировали значительно повышенную экспрессию Th по сравнению с образцами Th-нейронов и микроглий. Th-нейроны показали значительную экспрессию Gcg, предполагая, что образцы Th-нейронов обогащены нейронами, которые используют Glp1 в качестве нейротрансмиттера.
Линейный дискриминирующий анализ показал, что эти три типа клеток имели разные профили экспрессии генов во всех 65 генах. Клеточные субфенотипы образцов обогащенных Glp1 нейронов через временной ряд отмены алкоголя были представлены с использованием тепловых карт. Субфенотип А, который высоко экспрессирует воспалительный кластер генов, увеличивается в соотношении в восьмичасовой точке времени отмены и достигает максимума через 32 часа отмены.
Воспалительный субфенотип нормализуется для контроля к 176-часовой отмене. Субфенотип B, который высоко экспрессирует второй кластер генов рецептора ГАМК, демонстрирует общее подавление экспрессии этого кластера генов 176-часовым состоянием отмены. Экспрессия генов отдельных образцов была объединена в средние значения, так что экспрессия кластеров генов и расположение белка этого транскрипта гена могли быть визуализированы на протяжении всего временного ряда.
Этот метод может быть применен к любой биологической системе или ткани, чтобы понять клеточный ответ на болезнь или возмущение. То есть расшифровать молекулярный ответ при разрешении одной клетки, относящийся к пространственной и анатомической архитектуре ткани.
