הפרוטוקול רגיש מאוד ומאפשר לכידת תפוקה גבוהה של פרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד. הטכניקה מספקת ספציפיות מרחבית ומולקולרית אנטומית ברזולוציה של תא בודד. לאחר קצירת המוח, בחירת התאים הבודדים והכנת ה-mRNA, מזריקים נוזל קו בקרה לתוך שבב ה-qPCR לצורך הקדמה.
הכנס את שבב ה- qPCR להתקן הערבוב המיקרופלואידי. בחר את סקריפט Prime והפעל את התוכנית. לאחר השלמת התוכנית, הסר את שבב ה- qPCR הראשוני ופיפט שישה מיקרוליטרים של התגובה מצלחת הדגימה של ה- PCR לתוך הדגימה המתאימה היטב בשבב qPCR המוכנה.
כעת, פיפטה שישה מיקרוליטרים של התגובה מצלחת בדיקת ה- PCR לתוך הבדיקה המתאימה היטב בשבב qPCR המוכנה. לאחר מכן הכנס את השבב למכשיר הערבוב המיקרופלואידי. בחר את הסקריפט Load Mix והפעל את התוכנית.
הפעל את פלטפורמת RT-qPCR המיקרופלואידית וחמם את הנורה. הסר את שבב ה- qPCR ממכשיר הערבוב המיקרופלואידי וקלף את מדבקת המגן מתחתית השבב. פתח את פלטפורמת RT-qPCR המיקרופלואידית וטען את שבב ה- qPCR לפלטפורמה.
הפעל את תוכנת איסוף הנתונים על ידי לחיצה על התחל הפעלה חדשה. אמת את ברקוד השבב ואת סוג השבב. לאחר מכן לחץ על הבא.
בחר את קובץ הפעלת השבב ועיין במיקום הקובץ עבור אחסון איסוף הנתונים. לאחר מכן לחץ על סוג יישום ובחר ביטוי גנים. בחר ROX עבור הפניה פסיבית, בדיקה בודדת, ו- EVAGreen עבור סוג בדיקה.
לחץ כדי לבחור את תוכנית המחזור התרמי ובחר Biomark HD GE: מהיר 96x96 PCR + Melt v2. קובץ PCL. הורד את תוכנת ניתוח הנתונים.
הפעל את התוכנה כדי לנתח את הניסוי המיקרופלואידי RT-qPCR. לחץ על הפעלת שבבים ופתח את ChipRun. קובץ BML שנוצר על ידי הנסיין.
חלון המציג את פרטי הניסוי כולל הפניה פסיבית, בדיקה ותוכנית תרמית PCR יופיע. תחת הכרטיסיה סייר השבבים, לחץ על הגדרת צלחת לדוגמה וצור תבנית לוח לדוגמה חדשה. העתק והדבק את התוויות לדוגמה בגיליון האלקטרוני של התוכנה בהתאם לתכנון הניסוי.
הזן את שם הדגימה ואת ריכוז הרנ"א המשמש לדגימות הסטנדרטיות. כעת, מפה את הדוגמה שהוגדרה על-ידי לחיצה על מפה מתפריט המשימה ובחירה ב- SBS96-Left.dsp. לאחר מכן, בחר תצוגות פירוט כדי לעדכן שינויים אלה בקובץ ולחץ על נתח.
בחר הגדרת לוח גלאי וצור לוח בדיקה חדש. בחר את סוג הגורם המכיל והתבנית המתאימים. הדבק את שמות הבדיקה לפי תכנון הניסוי ולחץ על נתח.
בחלונית הגדרות ניתוח, לחץ על המשתמש והגדר את ההתאמה לאוטומטית. כעת, סקור ידנית כל תגובה בשבב 96x96. דמיינו את עקומות ההגברה וההתכה כדי לקבוע אם כל תגובה תואמת את תבנית ה-qPCR הצפויה.
אם עקומת ההגברה או ההיתוך אינה תואמת את הצפוי, נכשלו בתגובה זו. לאחר QC, ייצא את הנתונים על-ידי בחירת קובץ, לחיצה על ייצוא ושמירת ערכת הנתונים כקובץ csv. מכיוון שקובץ ה- csv המיוצא כולל גם מטריצת כשל של של מעבר וגם מטריצה עם ערכי CT גולמיים, השתמש במטריצת הכשל של כדי להחליף תאים שנכשלו בערכת הנתונים ב- NA. הורד את הגרסה האחרונה של תוכנת קוד פתוח R ולאחר מכן הורד את היישום R Studio.
עבור מרכוז חציוני, השתמש בתוכנה R כדי לחשב את ערך ה- CT החציוני המחושב מכל ערכי ה- CT עבור מדגם בודד ולאחר מכן הפחת את כל ערכי ה- CT הבודדים מערך חציוני זה כדי לקבל ערך CT דלתא מינוס. לנורמליזציה של גנים ביתיים, חשב את הביטוי הממוצע של הגנים של משק הבית עבור כל דגימה והשתמש בערך זה כדי להפחית את ערכי ה- CT הבודדים. כדי ליצור ערך דלתא CT של מינוס דלתא, הפעל את הקוד בתוכנת R.
העלה את ערכת הנתונים המנורמלת ל- R ונתח את הנתונים באמצעות פונקציית קנה המידה, צור את הנתונים שקנה המידה שלהם השתנה ולאחר מכן השתמש בפונקציית מפת החום R או בתוכנה נפרדת כדי ליצור מפת חום. כדי לארגן את ערכת הנתונים עבור פונקציונליות אחרת, חשב את המתאמים של פירסון בין כל גן ולאחר מכן את פונקציית ההמסה. ייצא והעלה נתונים אלה לתוכנת רשת מתאם גנים.
תאי עצב הראו ביטוי מוגבר של NeuN ודגימות מיקרוגליאליות הראו ביטוי משמעותי של הסמנים המיקרוגליאליים Cd34 ו-Cx3xr1. דגימות Th+neuronal הדגימו ביטוי מוגבר באופן משמעותי של Th בהשוואה לדגימות תאי עצב ומיקרוגליה. תאי העצב של Th-הציגו ביטוי משמעותי של Gcg, מה שמרמז על כך שדגימות תאי עצב מועשרות בתאי עצב המשתמשים ב-Glp1 כמוליך עצבי.
ניתוח הבחנה ליניארית הראה שלשלושת סוגי התאים האלה היו פרופילי ביטוי גנים שונים בכל 65 הגנים. תת-פנוטיפים תאיים של דגימות נוירונים מועשרות Glp1 באמצעות סדרת זמן גמילה מאלכוהול היו מיוצגים באמצעות מפות חום. תת-הפנוטיפ A, המבטא מאוד את אשכול הגנים הדלקתיים 1, עולה ביחס בנקודת הזמן של שמונה שעות הגמילה ומגיע למקסימום של נסיגה של 32 שעות.
תת פנוטיפ דלקתי מנורמל לשלוט על ידי נסיגה של 176 שעות. תת-פנוטיפ B, המבטא מאוד את אשכול הגנים של קולטן GABA 2, מדגים דיכוי כולל בביטוי של אשכול גנים זה על ידי מצב נסיגה של 176 שעות. ביטוי הגנים של דגימות בודדות שולב בממוצעים, כך שניתן היה להמחיש את הביטוי של אשכולות גנים ואת מיקום החלבון של אותו תעתיק גן לאורך כל סדרת הזמן.
טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת ביולוגית או רקמה כדי להבין את התגובה התאית למחלה או להפרעה. כלומר לפענח את התגובה המולקולרית ברזולוציה של תא בודד המתייחסת לארכיטקטורה המרחבית והאנטומית של הרקמה.
