Il protocollo è altamente sensibile e consente un'elevata acquisizione del profilo di espressione genica alla risoluzione di una singola cellula. La tecnica fornisce sia specificità anatomiche spaziali che molecolari a risoluzione singola cellulare. Dopo aver raccolto il cervello, selezionato le singole cellule e preparato l'mRNA, iniettare il fluido della linea di controllo nel chip qPCR per il priming.
Inserire il chip qPCR nel dispositivo di miscelazione microfluidica. Selezionare lo script Prime ed eseguire il programma. Dopo il completamento del programma, rimuovere il chip qPCR innescato e pipettare sei microlitri della reazione dalla piastra di campionamento PCR nel pozzetto campione corrispondente nel chip qPCR innescato.
Ora, pipettare sei microlitri della reazione dalla piastra di analisi PCR nel pozzetto di analisi corrispondente nel chip qPCR innescato. Quindi inserire il chip nel dispositivo di miscelazione microfluidica. Selezionare lo script Load Mix ed eseguire il programma.
Accendere la piattaforma microfluidica RT-qPCR e riscaldare la lampadina. Rimuovere il chip qPCR dal dispositivo di miscelazione microfluidica e staccare l'adesivo protettivo dalla parte inferiore del chip. Aprire la piattaforma microfluidica RT-qPCR e caricare il chip qPCR nella piattaforma.
Avviare il software di raccolta dati facendo clic su Inizia una nuova esecuzione. Verificare il codice a barre del chip e il tipo di chip. Quindi fare clic su Avanti.
Selezionare il file di esecuzione del chip e sfogliare il percorso del file per l'archiviazione della raccolta dati. Quindi fare clic su Tipo di applicazione e selezionare Espressione genica. Selezionare ROX per un riferimento passivo, una sonda singola e EVAGreen per il tipo di sonda.
Fare clic per selezionare il programma di cicli termici e selezionare Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2. PCL. Scarica il software di analisi dei dati.
Avviare il software per analizzare l'esperimento microfluidico RT-qPCR. Fare clic su Chip Run e aprire ChipRun. BML creato dallo sperimentatore.
Apparirà una finestra che mostra i dettagli sperimentali tra cui il riferimento passivo, la sonda e il programma termico PCR. Nella scheda Esplora chip, fare clic su Impostazione piastra campione e creare un nuovo modello di piastra campione. Copiare e incollare le etichette di esempio nel foglio di calcolo del software secondo il progetto sperimentale.
Inserire il nome del campione e la concentrazione di RNA utilizzata per i campioni standard. A questo punto, mappare l'impostazione di esempio facendo clic su mappa dal menu attività e selezionando SBS96-Left.dsp. Quindi, selezionare Viste di dettaglio per aggiornare queste modifiche nel file e fare clic su Analizza.
Selezionare Detector Plate Setup (Impostazione piastra rivelatore) e creare una nuova piastra di analisi. Selezionare il tipo e il formato del contenitore appropriati. Incollare i nomi del test secondo il disegno sperimentale e fare clic su Analizza.
Nel riquadro delle impostazioni di analisi, fare clic su Utente e impostare l'adattamento su automatico. Ora, rivedi manualmente ogni reazione nel chip 96x96. Visualizza le curve di amplificazione e fusione per determinare se ogni reazione ha seguito il modello qPCR previsto.
Se la curva di amplificazione o fusione non corrisponde a quanto previsto, fallire quella reazione. Dopo Controllo qualità, esporta i dati selezionando file, facendo clic su Esporta e salvando il set di dati come file CSV. Poiché il file csv esportato ha sia una matrice di esito negativo che una matrice con valori CT non elaborati, utilizzare la matrice di esito negativo per sostituire eventuali celle non riuscite nel set di dati con NA. Scarica la versione recente del software open Source R e scarica l'applicazione R Studio.
Per la centratura mediana, utilizzare il software R per calcolare il valore CT mediano calcolato da tutti i valori CT per un singolo campione e quindi sottrarre tutti i singoli valori CT da questo valore mediano per ottenere un valore CT delta meno. Per la normalizzazione dei geni di housekeeping, calcolare l'espressione media dei geni housekeeping per ciascun campione e utilizzare questo valore per sottrarre i singoli valori CT. Per generare un valore CT delta delta meno, eseguire il codice nel software R.
Caricare il set di dati normalizzato in R e analizzare i dati utilizzando la funzione di scala, generare i dati ridimensionati, quindi utilizzare la funzione mappa di calore R o un software separato per generare una mappa di calore. Per organizzare il set di dati per altre funzionalità, calcolare le correlazioni di Pearson tra ciascun gene seguito dalla funzione di fusione. Esporta e carica questi dati in un software di rete di correlazione genica.
I neuroni hanno mostrato un'elevata espressione di NeuN e campioni microgliali hanno mostrato un'espressione significativa dei marcatori microgliali Cd34 e Cx3xr1. I campioni Th+neuronali hanno dimostrato un'espressione significativamente elevata di Th rispetto ai campioni Th-neuronale e microglia. I neuroni Th, mostrando un'espressione significativa di Gcg, suggerendo che i campioni di Th-neuronal sono arricchiti con neuroni che usano Glp1 come neurotrasmettitore.
L'analisi discriminante lineare ha mostrato che questi tre tipi di cellule avevano profili di espressione genica diversi in tutti i 65 geni. I sottofenotipi cellulari di campioni di neuroni arricchiti con Glp1 attraverso una serie temporale di astinenza dall'alcol sono stati rappresentati utilizzando mappe di calore. Il subfenotipo A, che esprime altamente il cluster genico infiammatorio uno, aumenta in rapporto al punto di tempo di sospensione di otto ore e raggiunge un massimo a 32 ore di prelievo.
Il sottofenotipo infiammatorio viene normalizzato per il controllo mediante sospensione di 176 ore. Il sottofenotipo B, che esprime altamente il cluster di geni del recettore GABA due, dimostra una soppressione complessiva nell'espressione di questo cluster genico da parte della condizione di sospensione di 176 ore. L'espressione genica dei singoli campioni è stata combinata in medie in modo che l'espressione dei cluster genici e la posizione proteica di quel trascritto genico potessero essere visualizzate attraverso le serie temporali.
Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi sistema biologico o tessuto per comprendere la risposta cellulare a una malattia o a una perturbazione. Cioè decifrare la risposta molecolare a risoluzione singola cellulare relativa all'architettura spaziale e anatomica del tessuto.
