Protokol oldukça hassastır ve tek hücre çözünürlüğünde gen ekspresyon profilinin yüksek verimli yakalanmasını sağlar. Teknik, tek hücre çözünürlüğünde hem anatomik uzamsal hem de moleküler özgüllük sağlar. Beyni topladıktan sonra, tek hücreleri seçtikten ve mRNA'yı hazırladıktan sonra, astarlama için qPCR çipine kontrol hattı sıvısı enjekte edin.
qPCR çipini mikroakışkan karıştırma cihazına takın. Prime komut dosyasını seçin ve programı çalıştırın. Programın tamamlanmasından sonra, astarlanmış qPCR çipini çıkarın ve PCR numune plakasından reaksiyonun altı mikrolitresini astarlanmış qPCR çipindeki ilgili numune kuyusuna pipetleyin.
Şimdi, PCR tahlil plakasından gelen reaksiyonun altı mikrolitresini, astarlanmış qPCR çipindeki karşılık gelen tahlil kuyusuna pipetleyin. Ardından çipi mikroakışkan karıştırma cihazına yerleştirin. Load Mix komut dosyasını seçin ve programı çalıştırın.
Mikroakışkan RT-qPCR platformunu açın ve ampulü ısıtın. qPCR çipini mikroakışkan karıştırma cihazından çıkarın ve koruyucu etiketi çipin altından soyun. Mikroakışkan RT-qPCR platformunu açın ve qPCR çipini platforma yükleyin.
Yeni Bir Çalıştırma Başlat'a tıklayarak veri toplama yazılımını başlatın. Çip barkodunu ve çip türünü doğrulayın. Ardından İleri'ye tıklayın.
Çip çalıştırma dosyasını seçin ve veri toplama depolama alanı için dosya konumuna göz atın. Ardından Uygulama Türü'ne tıklayın ve Gen İfadesi'ni seçin. Pasif başvuru için ROX, tek prob ve prob türü için EVAGreen seçin.
Termal döngü programını seçmek için tıklayın ve Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2'yi seçin. pcl dosyası. Veri analiz yazılımını indirin.
Mikroakışkan RT-qPCR deneyini analiz etmek için yazılımı başlatın. Chip Run (Çip Çalıştır) düğmesini tıklatın ve ChipRun öğesini açın. Deneyci tarafından oluşturulan bml dosyası.
Pasif referans, prob ve PCR termal programı dahil olmak üzere deneysel ayrıntıları gösteren bir pencere açılacaktır. Chip Explorer sekmesi altında, Örnek Plaka Kurulumu'nu tıklatın ve yeni bir örnek plaka şablonu oluşturun. Örnek etiketleri kopyalayıp deneysel tasarıma göre yazılım elektronik tablosuna yapıştırın.
Numune adını ve standart numuneler için kullanılan RNA konsantrasyonunu girin. Şimdi, görev menüsünden haritala'yı tıklatıp SBS96-Left.dsp'yi seçerek örnek kurulumunu eşleyin. Ardından, dosyadaki bu değişiklikleri güncelleştirmek için Ayrıntı Görünümleri'ni seçin ve Çözümle'ye tıklayın.
Dedektör Plakası Kurulumu'nu seçin ve yeni bir tahlil plakası oluşturun. Uygun kapsayıcı türünü ve biçimini seçin. Tahlil adlarını deneysel tasarıma göre yapıştırın ve Analiz Et'e tıklayın.
Çözümleme ayarları bölmesinde, Kullanıcı'yı tıklatın ve sığdır'ı otomatik olarak ayarlayın. Şimdi, 96x96 çipteki her reaksiyonu manuel olarak gözden geçirin. Her reaksiyonun beklenen qPCR modelini takip edip etmediğini belirlemek için amplifikasyon ve erime eğrilerini görselleştirin.
Amplifikasyon veya erime eğrisi beklenenle eşleşmezse, bu reaksiyonu başarısızlığa uğratın. QC'yi takiben, dosyayı seçip dışa aktar'ı tıklatarak ve veri kümesini csv dosyası olarak kaydederek verileri dışarı aktarın. Dışa aktarılan csv dosyasında hem bir başarılı başarısız matrisi hem de ham CT değerleri olan bir matris bulunduğundan, veri kümesindeki başarısız hücreleri NA ile değiştirmek için başarılı başarısız matrisini kullanın. Açık Kaynak R yazılımının en son sürümünü indirin ve ardından R Studio uygulamasını indirin.
Medyan merkezleme için, tek bir örnek için tüm BT değerlerinden hesaplanan medyan BT değerini hesaplamak için R yazılımını kullanın ve ardından eksi delta BT değeri elde etmek için tüm bireysel BT değerlerini bu medyan değerden çıkarın. Temizlik gen normalizasyonu için, her örnek için temizlik genlerinin ortalama ekspresyonunu hesaplayın ve bireysel BT değerlerini çıkarmak için bu değeri kullanın. Eksi delta delta CT değeri oluşturmak için, kodu R yazılımında çalıştırın.
Normalleştirilmiş veri kümesini R'ye yükleyin ve ölçek işlevini kullanarak verileri analiz edin, ölçeklendirilmiş verileri oluşturun ve ardından bir ısı haritası oluşturmak için R ısı eşlemesi işlevini veya ayrı bir yazılımı kullanın. Veri kümesini diğer işlevler için düzenlemek için, her gen arasındaki Pearson korelasyonlarını ve ardından eriyik fonksiyonunu hesaplayın. Bu verileri bir gen korelasyon ağı yazılımına aktarın ve yükleyin.
Nöronlar NeuN'nin yüksek ekspresyonunu gösterdi ve mikroglial örnekler mikroglial belirteçler Cd34 ve Cx3xr1'in anlamlı ekspresyonunu gösterdi. Th + nöronal örnekleri, Th-nöronal ve mikroglia örneklerine kıyasla Th'nin ekspresyonunun anlamlı derecede yükseldiğini göstermiştir. Th-nöronları, Gcg'nin önemli bir ekspresyonunu gösterdi, bu da Th-nöronal örneklerin Glp1'i nörotransmitter olarak kullanan nöronlarla zenginleştirildiğini düşündürdü.
Doğrusal ayrım analizi, bu üç hücre tipinin 65 genin tümünde farklı gen ekspresyon profillerine sahip olduğunu göstermiştir. Glp1 ile zenginleştirilmiş nöron örneklerinin hücresel alt fenotipleri, bir alkol yoksunluk zaman serisi aracılığıyla ısı haritaları kullanılarak temsil edildi. Enflamatuar gen kümesini yüksek oranda eksprese eden alt fenotip A, sekiz saatlik çekilme zaman noktasında orantılı olarak artar ve 32 saatlik geri çekilmede maksimuma ulaşır.
İnflamatuar alt fenotip, 176 saatlik geri çekilme ile kontrol altına almak için normalleştirilir. GABA reseptör gen kümesi ikisini yüksek oranda eksprese eden alt fenotip B, bu gen kümesinin ekspresyonunda 176 saatlik geri çekilme koşuluyla genel bir baskılanma olduğunu göstermektedir. Bireysel örneklerin gen ekspresyonu ortalamalar halinde birleştirildi, böylece gen kümelerinin ekspresyonu ve bu gen transkriptinin protein konumu zaman serileri boyunca görselleştirilebildi.
Bu teknik, bir hastalığa veya pertürbasyona hücresel yanıtı anlamak için herhangi bir biyolojik sisteme veya dokuya uygulanabilir. Bu, dokunun mekansal ve anatomik mimarisi ile ilgili tek hücre çözünürlüğündeki moleküler yanıtı deşifre etmektir.
