El protocolo es altamente sensible y permite la captura de alto rendimiento del perfil de expresión génica a una resolución de una sola célula. La técnica proporciona especificidad anatómica espacial y molecular a una resolución de una sola célula. Después de cosechar el cerebro, seleccionar las células individuales y preparar el ARNm, inyecte líquido de la línea de control en el chip qPCR para el cebado.
Inserte el chip qPCR en el dispositivo de mezcla microfluídica. Seleccione el script Prime y ejecute el programa. Después de completar el programa, retire el chip qPCR cebado y pipete seis microlitros de la reacción de la placa de muestra de PCR en el pocillo de muestra correspondiente en el chip qPCR cebado.
Ahora, pipetear seis microlitros de la reacción de la placa de ensayo de PCR en el pocillo de ensayo correspondiente en el chip qPCR cebado. Luego inserte el chip en el dispositivo de mezcla microfluídica. Seleccione el script Load Mix y ejecute el programa.
Encienda la plataforma RT-qPCR microfluídica y caliente la bombilla. Retire el chip qPCR del dispositivo de mezcla microfluídica y despegue la etiqueta protectora de la parte inferior del chip. Abra la plataforma RT-qPCR microfluídica y cargue el chip qPCR en la plataforma.
Inicie el software de recopilación de datos haciendo clic en Iniciar una nueva ejecución. Verifique el código de barras del chip y el tipo de chip. Luego haga clic en siguiente.
Seleccione el archivo de ejecución de chip y busque la ubicación del archivo para el almacenamiento de recopilación de datos. Luego haga clic en Tipo de aplicación y seleccione Expresión génica. Seleccione ROX para una referencia pasiva, una sola sonda y EVAGreen para el tipo de sonda.
Haga clic para seleccionar el programa de ciclo térmico y seleccione Biomark HD GE: Fast 96x96 PCR + Melt v2. PCL. Descargue el software de análisis de datos.
Inicie el software para analizar el experimento RT-qPCR microfluídico. Haga clic en Chip Run y abra el ChipRun. BML creado por el experimentador.
Aparecerá una ventana que muestra los detalles experimentales, incluida la referencia pasiva, la sonda y el programa térmico de PCR. En la pestaña Explorador de chips, haga clic en Configuración de placa de muestra y cree una nueva plantilla de placa de muestra. Copie y pegue las etiquetas de muestra en la hoja de cálculo del software según el diseño experimental.
Introduzca el nombre de la muestra y la concentración de ARN utilizada para las muestras estándar. Ahora, asigne la configuración de ejemplo haciendo clic en mapa en el menú de tareas y seleccionando SBS96-Left.dsp. A continuación, seleccione Vistas detalladas para actualizar estos cambios en el archivo y haga clic en Analizar.
Seleccione Configuración de la placa del detector y cree una nueva placa de ensayo. Seleccione el tipo y formato de contenedor adecuado. Pegue los nombres de los ensayos según el diseño experimental y haga clic en Analizar.
En el panel de configuración de análisis, haga clic en Usuario y establezca el ajuste en automático. Ahora, revise manualmente cada reacción en el chip 96x96. Visualice las curvas de amplificación y fusión para determinar si cada reacción siguió el patrón de qPCR esperado.
Si la curva de amplificación o fusión no coincide con lo que se espera, falla esa reacción. Después de QC, exporte los datos seleccionando archivo, haciendo clic en exportar y guardando el conjunto de datos como un archivo csv. Como el archivo csv exportado tiene una matriz de error de paso y una matriz con valores CT sin procesar, use la matriz de error de paso para reemplazar las celdas fallidas del conjunto de datos con NA. Descargue la versión reciente del software de código abierto R y, a continuación, descargue la aplicación R Studio.
Para el centrado de la mediana, use el software R para calcular el valor medio de TC calculado a partir de todos los valores de TC para una muestra individual y luego reste todos los valores individuales de TC de este valor mediano para obtener un valor de TC menos delta. Para la normalización de genes de limpieza, calcule la expresión promedio de los genes de limpieza para cada muestra y use este valor para restar los valores individuales de TC. Para generar un valor menos delta delta CT, ejecute el código en el software R.
Cargue el conjunto de datos normalizado en R y analice los datos mediante la función de escala, genere los datos a escala y, a continuación, utilice la función de mapa de calor de R o software independiente para generar un mapa de calor. Para organizar el conjunto de datos para otras funcionalidades, calcule las correlaciones de Pearson entre cada gen seguido de la función de fusión. Exporte y cargue estos datos en un software de red de correlación de genes.
Las neuronas mostraron una expresión elevada de NeuN y las muestras microgliales mostraron una expresión significativa de los marcadores microgliales Cd34 y Cx3xr1. Las muestras Th+neuronales demostraron una expresión significativamente elevada de Th en comparación con las muestras Th-neuronales y microglia. Las neuronas Th mostraron una expresión significativa de Gcg, lo que sugiere que las muestras neuronales Th están enriquecidas con neuronas que usan Glp1 como neurotransmisor.
El análisis de discriminación lineal mostró que estos tres tipos de células tenían diferentes perfiles de expresión génica en los 65 genes. Los subfenotipos celulares de muestras de neuronas enriquecidas con Glp1 a través de una serie de tiempo de abstinencia de alcohol se representaron utilizando mapas de calor. El subfenotipo A, que expresa altamente el grupo de genes inflamatorios uno, aumenta en proporción en el punto de tiempo de retiro de ocho horas y alcanza un máximo a las 32 horas de retiro.
El subfenotipo inflamatorio se normaliza para controlar la retirada de 176 horas. El subfenotipo B, que expresa altamente el grupo dos de genes del receptor GABA, demuestra una supresión general en la expresión de este grupo de genes por la condición de abstinencia de 176 horas. La expresión génica de muestras individuales se combinó en promedios para que la expresión de grupos de genes y la ubicación de proteínas de esa transcripción génica pudieran visualizarse a lo largo de la serie temporal.
Esta técnica se puede aplicar a cualquier sistema biológico o tejido para comprender la respuesta celular a una enfermedad o una perturbación. Eso es descifrar la respuesta molecular a resolución de una sola célula relacionada con la arquitectura espacial y anatómica del tejido.
