이 프로토콜은 매우 민감하며 단일 세포 분해능에서 유전자 발현 프로필의 높은 처리량 캡처를 허용합니다. 이 기술은 단일 세포 분해능에서 해부학적 공간 및 분자 특이성을 모두 제공합니다. 뇌를 수확하고, 단일 세포를 선택하고, mRNA를 준비한 후, 프라이밍을 위해 qPCR 칩에 컨트롤 라인 유체를 주입한다.
qPCR 칩을 미세유체 혼합 장치에 삽입합니다. 프라임 스크립트를 선택하고 프로그램을 실행합니다. 프로그램 완료 후, 프라이밍된 qPCR 칩을 제거하고 PCR 샘플 플레이트로부터 반응물의 6마이크로리터를 피펫하여 프라이밍된 qPCR 칩의 상응하는 샘플 웰로 한다.
이제, PCR 분석 플레이트로부터의 반응물을 프라이밍된 qPCR 칩에 상응하는 분석 웰 내로 6 마이크로리터를 피펫팅한다. 그런 다음 칩을 미세유체 혼합 장치에 삽입합니다. 로드 믹스 스크립트를 선택하고 프로그램을 실행합니다.
미세유체 RT-qPCR 플랫폼을 켜고 전구를 예열합니다. 미세유체 혼합 장치에서 qPCR 칩을 제거하고 칩 바닥에서 보호 스티커를 벗겨냅니다. 미세유체 RT-qPCR 플랫폼을 열고 qPCR 칩을 플랫폼에 로드합니다.
새 실행 시작을 클릭하여 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다. 칩 바코드 및 칩 유형을 확인합니다. 그런 다음 다음을 클릭하십시오.
칩 실행 파일을 선택하고 데이터 수집 스토리지의 파일 위치를 찾습니다. 그런 다음 응용 프로그램 유형을 클릭하고 유전자 발현을 선택합니다. 수동 기준의 경우 ROX, 단일 프로브의 경우 EVAGreen을 선택하고 프로브 유형의 경우 EVAGreen을 선택합니다.
열 순환 프로그램을 클릭하여 선택하고 Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2를 선택합니다. PCL 파일에 저장됩니다. 데이터 분석 소프트웨어를 다운로드합니다.
소프트웨어를 실행하여 미세유체 RT-qPCR 실험을 분석합니다. 칩 실행을 클릭하고 ChipRun을 엽니다. 실험자가 만든 BML 파일입니다.
수동 기준, 프로브 및 PCR 열 프로그램을 포함한 실험 세부 정보를 표시하는 창이 나타납니다. 칩 탐색기 탭에서 샘플 플레이트 설정을 클릭하고 새 샘플 플레이트 템플릿을 만듭니다. 샘플 레이블을 복사하여 실험 설계에 따라 소프트웨어 스프레드시트에 붙여넣습니다.
표준 샘플에 사용되는 샘플 이름과 RNA 농도를 입력합니다. 이제 작업 메뉴에서 맵을 클릭하고 SBS96-Left.dsp를 선택하여 샘플 설정을 매핑합니다. 그런 다음 세부 정보 보기를 선택하여 파일에서 이러한 변경 내용을 업데이트하고 분석을 클릭합니다.
검출기 플레이트 설정을 선택하고 새 분석 플레이트를 생성합니다. 적절한 컨테이너 유형 및 형식을 선택합니다. 실험 설계에 따라 분석 이름을 붙여넣고 분석을 클릭합니다.
분석 설정 창에서 사용자를 클릭하고 피팅을 자동으로 설정합니다. 이제 96x96 칩의 각 반응을 수동으로 검토합니다. 증폭 및 용융 곡선을 시각화하여 각 반응이 예상되는 qPCR 패턴을 따르는지 확인합니다.
증폭 또는 용융 곡선이 예상과 일치하지 않으면 해당 반응에 실패합니다. QC 후 파일을 선택하고 내보내기를 클릭한 다음 데이터 세트를 csv 파일로 저장하여 데이터를 내보냅니다. 내보낸 csv 파일에는 통과 실패 행렬과 원시 CT 값이 있는 행렬이 모두 있으므로 통과 실패 행렬을 사용하여 데이터 세트의 실패한 셀을 NA로 바꿉니다. 최신 버전의 오픈 소스 R 소프트웨어를 다운로드한 다음 R Studio 애플리케이션을 다운로드합니다.
중앙값 중심화의 경우 R 소프트웨어를 사용하여 개별 샘플의 모든 CT 값에서 계산된 CT 중앙값 값을 계산한 다음 이 중앙값에서 모든 개별 CT 값을 빼서 마이너스 델타 CT 값을 얻습니다. 하우스키핑 유전자 정규화의 경우 각 샘플에 대한 하우스키핑 유전자의 평균 발현을 계산하고 이 값을 사용하여 개별 CT 값을 뺍니다. 마이너스 델타 델타 CT 값을 생성하려면 R 소프트웨어에서 코드를 실행합니다.
정규화된 데이터 세트를 R에 업로드하고 scale 함수를 사용하여 데이터를 분석하고 스케일링된 데이터를 생성한 다음 R 히트 맵 함수 또는 별도의 소프트웨어를 사용하여 히트 맵을 생성합니다. 다른 기능에 대한 데이터 세트를 구성하려면 각 유전자 간의 Pearson 상관 관계와 용융 함수를 계산하십시오. 이 데이터를 유전자 상관 네트워크 소프트웨어로 내보내고 업로드합니다.
뉴런은 NeuN의 상승된 발현을 나타내었고, 소교세포 샘플은 미세아교세포 마커 Cd34 및 Cx3xr1의 유의한 발현을 보였다. Th+뉴런 샘플은 Th-뉴런 및 미세아교세포 샘플에 비해 Th의 발현이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. Th- 뉴런은 Gcg의 유의 한 발현을 나타 냈으며, 이는 Th- 뉴런 샘플이 Glp1을 신경 전달 물질로 사용하는 뉴런으로 풍부하다는 것을 시사합니다.
선형 차별 분석은 이 세 가지 세포 유형이 65개 유전자 모두에서 상이한 유전자 발현 프로필을 갖는 것으로 나타났습니다. 알코올 금단 시계열을 통한 Glp1 농축 뉴런 샘플의 세포 하위 표현형은 히트 맵을 사용하여 표현하였다. 상기 서브 표현형 A는 염증성 유전자 클러스터를 고도로 발현하나, 8시간 금단 시점에서 비율이 증가하고, 32시간 금단 시점에서 최대에 도달한다.
염증성 서브 표현형은 176시간 금단에 의해 조절되도록 정상화된다. GABA 수용체 유전자 클러스터 2를 고도로 발현하는 서브 표현형 B는 176시간 금단 조건에 의해 이러한 유전자 클러스터의 발현에서 전반적인 억제를 나타낸다. 개별 샘플의 유전자 발현을 평균으로 결합하여 유전자 클러스터의 발현과 해당 유전자 전사체의 단백질 위치를 시계열 전체에 걸쳐 시각화할 수 있었습니다.
이 기술은 질병이나 섭동에 대한 세포 반응을 이해하기 위해 모든 생물학적 시스템이나 조직에 적용될 수 있습니다. 그것은 조직의 공간 및 해부학적 구조와 관련된 단일 세포 분해능에서 분자 반응을 해독하는 것입니다.
