يسمح هذا البروتوكول بتطوير الضربة القاضية لخلايا العضلات في أي جين ، من أجل مواصلة دراسة وظيفة هذا الجين في العضلات. الميزة هي أنها رخيصة وأسرع من تطوير الحيوانات القاضية لدراسة أي جين. يمكن استخدام هذه التقنية ، على سبيل المثال ، لدراسة تورط جين تم تحديده حديثا في اعتلال عضلي.
إذا تم تطبيق التقنية الموضحة هنا على خلايا iPS ، فقد يؤدي ذلك إلى تطوير خلايا بالضربة القاضية لأي جين في أي نوع من الخلايا. لبدء التكرار الباليندرومي القصير المتجمع بانتظام أو حذف الجينات بوساطة كريسبر، استخدم أولا أدوات متصفح الجينوم مثل المجموعة. لتحديد الجين المستهدف جنبا إلى جنب مع تسلسل الحمض النووي على جانبيه.
للحصول على قائمة الإكسونات الجينية ، انقر أولا على نص تسلسل ترميز البروتين ثم على Exons. بعد ذلك ، انقر فوق تنزيل التسلسل وحدد التسلسل الجيني فقط لتنزيل تسلسل الإجماع الكامل للجين بأكمله. قم بالتمرير في قائمة الإكسونات والإنترونات الخاصة بالجين لتحديد المستهدفين.
لتصميم الحمض النووي الريبي المرشد ، حدد أولا تسلسلات النيوكليوتيدات للإنترونات مباشرة في المنبع والمصب للتسلسل المستهدف. ثم انتقل إلى موقع ويب مثل crispr.tefor. صافي واستخدام التسلسلات المحددة لتصميم اثنين من الحمض النووي الريبي التوجيهي، كل 20 نيوكليوتيدات طويلة دون Protospacer Adjacent Motif مفصولة ببضع مئات من أزواج القواعد.
بعد ذلك ، حدد تسلسل المكمل العكسي لكل دليل RNA واطلب الاشعال . لإنشاء أشرطة RNA إرشادية لاستنساخ البلازميد ، قم أولا بتشغيل PCR مع مجموعة واحدة من الاشعال باستخدام الوصفة والبرنامج الموصوف في النص ، ثم افصل منتجات PCR في هلام 1٪ agarose باستخدام المخزن المؤقت Tris-borate-EDTA. بعد ذلك ، قم بقص جزء الزوج المكون من 300 قاعدة وتنقيته باستخدام مجموعة.
وبالمثل ، بعد تشغيل PCR آخر مع مجموعة التمهيدي الأخرى ، قم بتنقية جزء الحمض النووي الطويل المكون من 400 قاعدة إلى 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت. لإدخال أشرطة الحمض النووي الريبي الإرشادية في العمود الفقري للبلازميد الفيروسي ، قم أولا بإعداد تفاعل هضم مزدوج للبلازميد مع إنزيمات التقييد Xma 1 و Blp 1 كما هو موضح في النص. بعد احتضان أنبوب التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، احتضنه عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم قم بتشغيل منتج الهضم في هلام أغاروز 1٪ وتنقية البلازميد من حوالي 10 أزواج كيلو قاعدة باستخدام مجموعة مناسبة.
أيضا تحديد كمية المنتج النقي عن طريق قياس الكثافة البصرية. لربط كاسيت الحمض النووي الريبي الإرشادي بالبلازميد، قم بإعداد مزيج تفاعل مع الحمض النووي الريبي الموجه النقي، والحمض النووي البلازميدي الخطي، والإنزيم، والماء إلى حجم نهائي من 10 ميكرولترات، ثم احتضن أنبوب التفاعل عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتوليد البلازميد النهائي، المسمى pGuide. لإنتاج فيروس lentivirus ، قم أولا بزرع صفيحة 145 سم مع مليون خلية HEK 293 في DMEM مع ارتفاع الجلوكوز والبيروفات مع استكمال 10٪ FBS و 1٪ البنسلين أو الستربتومايسين.
ثم تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. في اليوم الرابع تحقق من الخلايا لضمان التقاء 60 إلى 65 ٪. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول النقل الذي يتكون من البلازميد محل الاهتمام ، والبلازميد الذي يشفر غلاف الفيروس ، وبلازميد التعبئة الفيروسية lentiviral psPAX2 ، وفوسفات الكالسيوم.
اضبط الحجم النهائي على 1000 ميكرولتر بالماء. ثم أضف محلول النقل قطرة إلى ملليلتر واحد من 2X HBS تحت الإثارة واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل. بعد ذلك ، أضف المحلول قطرة إلى الخلايا.
للحصول على توزيع متجانس لمحلول النقل ، قم بإمالة اللوحة بلطف في جميع الاتجاهات ، ثم احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة خمس ساعات على الأقل. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسائط من الألواح واغسل الخلايا باستخدام PBS للتخلص من كواشف النقل ، ثم أضف 12 ملليلتر من الوسط الطازج. بعد 48 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، قم بتجميع الوسائط من جميع الألواح في أنبوب.
ضع الأنبوب في دلو مغلق وجهاز طرد مركزي بسرعة 800 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، ثم قم بتصفية السوبرنات باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر وقم بالطرد المركزي للترشيح عند 68،300 مرة G لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية ، باستخدام دوار دلو متأرجح. بعد إزالة السوبرناتانت ، احتفظ بالأنابيب رأسا على عقب على منشفة ورقية في خزانة أمان لمدة خمس إلى 10 دقائق لإزالة السائل من الكريات إلى أقصى حد. أضف 100 ميكرولتر من وسط انتشار HEC واحتفظ بالأنابيب عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل.
ثم أعد تعليق الكريات عن طريق السحب. بعد جمع جميع الكريات المعاد تعليقها ، قم بعمل أليكوتس من 10 أو 25 ميكرولتر ، ثم قم بتخزين الأليكوت عند 80 درجة مئوية تحت الصفر بعد التجميد المفاجئة في الهيدروجين السائل. لنقل اللاستيدات العضلية ، قم أولا بزرع كل بئر من صفيحة 96 بئرا مع 100 ميكرولتر من وسط الانتشار يحتوي على 10،000 خلية myoblast.
في اليوم التالي، أضف كميات محسوبة مسبقا من أدلة الجهد المنخفض و LV Cas9 إلى الخلايا الموجودة في خزانة الأمان. بعد خمسة أيام من الحضانة ، حرر الخلايا من البئر بإضافة التربسين. بعد حساب أرقام الخلايا ، انقل الخلايا من الآبار ذات التقاء 40 إلى 50٪ إلى لوحة جديدة.
بعد خمس ساعات من الحضانة ، أضف كميات محسوبة من قاتل LV عند عدد كبير من العدوى يبلغ 20 واحتضن لمدة خمسة إلى 10 أيام أو على الأقل مقطعين بينهما. للتوصيف الوظيفي للنسخ المعدلة جينيا عن طريق تصوير الكالسيوم ، لوحة 50،000 خلية في وسط طبق 35 ملم مغلف بالصفيحة. للحث على التمايز، أضف وسيط التمايز كما هو موضح في النص.
بعد ستة أيام من الحضانة ، قم بخلع وسط الثقافة وحدد الخلايا بقلم مسعور. ثم أضف 50 ميكرولتر من Fluo-4 Direct ، المخفف واحدا إلى واحد في وسط التمايز ، إلى الأنابيب العضلية المتباينة. بعد احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن كريبس العازل مع استكمال ملليغرام واحد لكل ملليلتر من الجلوكوز.
بعد ذلك ، استخدم مجهر التألق المقلوب أو المجهر البؤري مع هدف 10X لقياس اختلافات التألق بمعدل إطار واحد في الثانية لمدة 90 ثانية واختيار حقل يحتوي على 10 أنابيب عضلية على الأقل. بعد إزالة المخزن المؤقت الإضافي Krebs ، قم بتحفيز الخلايا بملليلتر من كلوريد البوتاسيوم لإزالة الاستقطاب الغشائي أو ملليلترين من ميتاكريسول فلوروكلورول أو 4CmC أو RyR1 التحفيز المباشر. تصور تباين التألق بعد التحفيز ، ثم حدد مقدار تباين التألق في كل أنبوب عضلي.
يمكن استخدام هذا البروتوكول بنجاح لإخراج الجين RyR1 من الأرومات العضلية البشرية ، مما أدى إلى أقصر الحمض النووي الجينومي في الخلايا. كما تم تأكيد خروج RyR1 بالضربة القاضية على مستوى البروتين حيث لا يمكن اكتشاف بروتين RyR1 في الخلايا المستهدفة عن طريق النشاف الغربي. تم التحقق من عدم وجود نشاط RyR1 في الأنابيب العضلية المتباينة عن خلايا RyR1 القاضية عن طريق تصوير الكالسيوم Fluo-4 بعد التحفيز المباشر RyR1 بواسطة 4CmC أو التحفيز غير المباشر عن طريق إزالة الاستقطاب الغشائي الناجم عن كلوريد البوتاسيوم.
يجب أن يكون التسلسل الذي سيتم حذفه مطلوبا للتنبؤ بالبروتين الوظيفي. هذه التقنية مثالية لتطوير أدوات ما بعد الجينوم لدراسة تورط جين جديد في أمراض العضلات.
