该协议允许在任何基因中开发肌肉细胞敲除，以进一步研究该基因在肌肉中的功能。优点是它比研究任何基因的敲除动物的发育便宜，更快。例如，这种技术可用于研究新发现的基因在肌病中的参与。
如果将这里描述的技术应用于iPS细胞，它可能导致任何类型的细胞中任何基因的敲除细胞的发展。要开始成簇的有规律间隔的短回文重复序列或CRISPR介导的基因缺失，首先使用基因组浏览器工具，如ensembl。org来鉴定靶基因及其两侧的DNA序列。
要获得基因外显子的列表，首先单击蛋白质编码序列的转录本，然后单击外显子。接下来，点击下载序列，仅选择基因组序列，下载整个基因的完整共识序列。滚动基因的外显子和内含子列表以选择靶向的外显子和内含子。
为了设计引导RNA，首先选择靶序列上游和下游内含子的核苷酸序列。然后去一个网站，如crispr.tefor。网并使用选定的序列来设计两个引导RNA，每个RNA长20个核苷酸，没有原始间隔相邻基序，由几百个碱基对隔开。
接下来确定每个引导RNA的反向补体序列并对引物进行排序。为了构建用于质粒克隆的指导RNA盒，首先使用文本中描述的配方和程序使用一组引物运行PCR，然后使用Tris-borate-EDTA缓冲液在1%琼脂糖凝胶中分离PCR产物。接下来切除300碱基对碎片并使用试剂盒纯化。
同样，在用另一组引物运行另一个PCR后，将400碱基对长的DNA片段纯化成20微升的洗脱缓冲液。要将引导RNA盒插入慢病毒质粒主链中，首先按照文中所述设置质粒与限制性内切酶Xma 1和Blp 1的双重消化反应。将反应管在37摄氏度孵育一小时后，将其在65摄氏度孵育20分钟，然后在1%琼脂糖凝胶中运行消化产物，并使用适当的试剂盒纯化约10千碱基对的质粒。
还可以通过测量光密度来量化纯化产物。将引导RNA盒与质粒结合，与纯化的引导RNA，线性化的质粒DNA，酶和水制备反应混合物至最终体积为10微升，然后将反应管在50摄氏度下孵育15分钟以产生最终质粒，称为pGuide。对于慢病毒生产，首先在DMEM中用100万HEK 293细胞的145厘米板接种，其中含有高葡萄糖和丙酮酸，并补充10%FBS和1%青霉素或链霉素。
然后将细胞在37摄氏度下在5%二氧化碳培养箱中生长三天。第四天检查细胞以确保60%至65%的汇合度。接下来制备由目标质粒、编码病毒包膜的质粒、慢病毒包装质粒psPAX2和磷酸钙组成的转染溶液。
用水将最终体积调节至1000微升。然后在搅拌下将转染溶液滴加到一毫升2X HBS中，并在室温下孵育至少10分钟。之后，将溶液滴加到细胞中。
对于转染溶液的均匀分布，轻轻地向所有方向倾斜板，然后将细胞在37摄氏度下在5%二氧化碳培养箱中孵育至少五个小时。接下来，从平板中取出培养基并用PBS洗涤细胞以除去转染试剂，然后加入12毫升新鲜培养基。在37摄氏度下孵育48小时后，将所有板中的培养基池化到管中。
将管放入密封桶中，在4摄氏度下以800倍G离心5分钟，然后使用0.45微米过滤器过滤上清液，并使用摆动桶转子将滤液以68，300倍G离心两小时，在4摄氏度下。除去上清液后，将管子倒置在安全柜中的纸巾上5至10分钟，以最大程度地从颗粒中除去液体。加入100微升HEC增殖培养基，并将管保持在四摄氏度至少两小时。
然后通过移液重悬沉淀。收集所有重悬的颗粒后，制作10或25微升的等分试样，然后在液态氢中速冻后将等分试样储存在零下80摄氏度。对于成肌细胞转导，首先用100微升含有10， 000个成肌细胞的增殖培养基接种96孔板的每个孔。
第二天，将预先计算的左心室导线和左心室Cas9体积添加到安全柜中的电池中。孵育五天后，通过添加胰蛋白酶从孔中释放细胞。计数细胞数量后，将细胞从具有40%至50%汇合度的孔转移到新板上。
孵育 5 小时后，在感染的多重程度 20 时加入计算体积的左心室杀手，并孵育 5 至 10 天或介于两者之间至少两次传代。为了通过钙成像对基因编辑克隆进行功能表征，在层粘连蛋白包被的35毫米培养皿的中心板上放置50， 000个细胞。要诱导分化，请添加文中描述的分化培养基。
孵育六天后，取下培养基并用疏水笔描绘细胞。然后向分化培养基中加入50微升的Fluo-4 Direct，一对一稀释到分化的肌管中。将培养皿在37摄氏度下孵育30分钟后，用Krebs缓冲液洗涤细胞两次，并补充每毫升葡萄糖一毫克。
接下来使用倒置荧光显微镜或具有10X物镜的共聚焦显微镜以每秒一帧的速率测量荧光变化90秒，并选择至少具有10个肌管的场。除去额外的克雷布斯缓冲液后，用两毫升氯化钾刺激细胞进行膜去极化或两毫升氟氯间甲酚或4CmC或RyR1直接刺激。可视化刺激后的荧光变化，然后量化每个肌管中的荧光变化。
该协议可以成功地用于从人类成肌细胞中敲除RyR1基因，这导致细胞中的基因组DNA更短。RyR1敲除也在蛋白质水平上得到证实，因为RyR1蛋白无法通过蛋白质印迹在靶细胞中检测到。通过4CmC直接RyR1刺激或氯化钾诱导膜去极化间接刺激后，通过Fluo-4钙成像进一步证实了与RyR1敲除细胞分化的肌管中RyR1活性的缺乏。
将要删除的序列应该是功能蛋白预测所必需的。该技术非常适合开发基因组后工具，以研究新基因在肌肉疾病中的参与。
