Questo protocollo consente lo sviluppo del knock-out delle cellule muscolari in qualsiasi gene, al fine di studiare ulteriormente la funzione di questo gene nel muscolo. Il vantaggio è che è economico e più veloce dello sviluppo di animali knock-out per studiare qualsiasi gene. Questa tecnica può essere utilizzata, ad esempio, per studiare il coinvolgimento di un gene appena identificato in una miopatia.
Se la tecnica qui descritta viene applicata alle cellule iPS può portare allo sviluppo di cellule knock-out per qualsiasi gene in qualsiasi tipo di cellule. Per iniziare a raggruppare brevi ripetizioni palindrome regolarmente intervallate o la delezione genica mediata da CRISPR, utilizzare prima gli strumenti del browser del genoma come ensembl. org per identificare il gene bersaglio insieme alle sequenze di DNA su entrambi i lati di esso.
Per ottenere l'elenco degli esoni genici, fare prima clic sulla trascrizione della sequenza di codifica proteica e poi su Exons. Quindi, fare clic su Scarica sequenza e selezionare solo Sequenza genomica per scaricare la sequenza di consenso completo dell'intero gene. Scorri l'elenco degli esoni e degli introni del gene per selezionare quelli mirati.
Per la progettazione dell'RNA guida, selezionare prima le sequenze nucleotidiche degli introni immediatamente a monte e a valle della sequenza target. Quindi vai su un sito Web come crispr.tefor. net e utilizzare le sequenze selezionate per progettare due RNA guida, ciascuno lungo 20 nucleotidi senza il Protospacer Adjacent Motif separato da poche centinaia di coppie di basi.
Quindi determinare la sequenza del complemento inverso per ciascun RNA guida e ordinare i primer. Per costruire cassette di RNA guida per la clonazione di plasmidi, eseguire prima una PCR con un set di primer utilizzando la ricetta e il programma descritti nel testo, quindi separare i prodotti PCR in gel di agarosio all'1% utilizzando il tampone Tris-borato-EDTA. Quindi asportare il frammento di coppia a 300 basi e purificare utilizzando un kit.
Allo stesso modo, dopo aver eseguito un'altra PCR con l'altro set di primer, purificare un frammento di DNA lungo una coppia di 400 basi in 20 microlitri di tampone di eluizione. Per inserire le cassette di RNA guida in una spina dorsale plasmidica lentivirale, impostare prima una doppia reazione di digestione del plasmide con gli enzimi di restrizione Xma 1 e Blp 1 come descritto nel testo. Dopo aver incubato il tubo di reazione a 37 gradi Celsius per un'ora, incubarlo a 65 gradi Celsius per 20 minuti, quindi eseguire il prodotto di digestione in un gel di agarosio all'1% e purificare il plasmide di circa 10 coppie di kilobasi utilizzando un kit appropriato.
Quantificare anche il prodotto purificato misurando la densità ottica. Per legare la cassetta dell'RNA guida con il plasmide, preparare una miscela di reazione con l'RNA guida purificato, il DNA plasmidico linearizzato, l'enzima e l'acqua a un volume finale di 10 microlitri, quindi incubare il tubo di reazione a 50 gradi Celsius per 15 minuti per generare il plasmide finale, chiamato pGuide. Per la produzione di lentivirus, seminare prima una piastra di 145 centimetri con 1 milione di HEK 293 cellule in DMEM con glucosio alto e piruvato integrato con il 10% fbS e l'1% di penicillina o streptomicina.
Quindi far crescere le cellule a 37 gradi Celsius per tre giorni in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Il quarto giorno controllare le cellule per garantire una confluenza dal 60 al 65%. Quindi preparare la soluzione di trasfezione costituita dal plasmide di interesse, dal plasmide che codifica l'involucro del virus, dal plasmide psPAX2 di imballaggio lentivirale e dal fosfato di calcio.
Regolare il volume finale a 1000 microlitri con acqua. Quindi aggiungere la soluzione di trasfezione a goccia a un millilitro di 2X HBS sotto agitazione e incubare a temperatura ambiente per almeno 10 minuti. Successivamente, aggiungere la soluzione dropwise alle celle.
Per una distribuzione omogenea della soluzione di trasfezione, inclinare delicatamente la piastra in tutte le direzioni, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5% per almeno cinque ore. Quindi, rimuovere il supporto dalle piastre e lavare le cellule con PBS per eliminare i reagenti di trasfezione, quindi aggiungere 12 millilitri di mezzo fresco. Dopo 48 ore di incubazione a 37 gradi Celsius, raggruppare il supporto da tutte le piastre in un tubo.
Mettere il tubo in un secchio sigillato e centrifugare a 800 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, quindi filtrare il surnatante usando un filtro da 0,45 micrometri e centrifugare il filtrato a 68, 300 volte G per due ore a quattro gradi Celsius, usando un rotore a benna oscillante. Dopo aver rimosso il surnatante, tenere i tubi capovolti su un tovagliolo di carta in un armadietto di sicurezza per cinque o 10 minuti per la massima rimozione del liquido dal pellet. Aggiungere 100 microlitri di mezzo di proliferazione HEC e mantenere i tubi a quattro gradi Celsius per almeno due ore.
Quindi risospesare il pellet mediante pipettaggio. Dopo aver raccolto tutti i pellet risospesi, fare aliquote di 10 o 25 microlitri, quindi conservare le aliquote a meno 80 gradi Celsius dopo il congelamento a scatto in idrogeno liquido. Per la trasduzione dei mioblasti, seminare prima ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri di terreno di proliferazione contenente 10.000 cellule di mioblasti.
Il giorno successivo, aggiungere volumi precalcolati di guide BT e LV Cas9 alle celle in un armadio di sicurezza. Dopo cinque giorni di incubazione, rilasciare le cellule dal pozzo aggiungendo tripsina. Dopo aver contato i numeri di cella, trasferire le celle dai pozzetti con una confluenza dal 40 al 50% a una nuova piastra.
Dopo cinque ore di incubazione, aggiungere volumi calcolati di LV killer a una molteplicità di infezione di 20 e incubare per cinque a 10 giorni o almeno due passaggi intermedi. Per la caratterizzazione funzionale dei cloni geneticamente modificati mediante imaging del calcio, piastra 50.000 cellule al centro di una parabola da 35 millimetri rivestita di laminina. Per indurre la differenziazione, aggiungere il mezzo di differenziazione come descritto nel testo.
Dopo sei giorni di incubazione, togliere il terreno di coltura e delineare le cellule con una penna idrofoba. Quindi aggiungere 50 microlitri di Fluo-4 Direct, diluiti uno a uno nel mezzo di differenziazione, ai miotubi differenziati. Dopo aver incubato i piatti a 37 gradi Celsius per 30 minuti, lavare le cellule due volte con tampone Krebs integrato con un milligrammo per millilitro di glucosio.
Quindi utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita o un microscopio confocale con un obiettivo 10X per misurare le variazioni di fluorescenza ad una velocità di un fotogramma al secondo per 90 secondi e scegliere un campo con almeno 10 miotubi. Dopo aver rimosso il tampone di Krebs aggiuntivo, stimolare le cellule con due millilitri di cloruro di potassio per la depolarizzazione della membrana o due millilitri di metacresolo floroclorale o stimolazione diretta 4CmC o RyR1. Visualizza la variazione di fluorescenza dopo la stimolazione, quindi quantifica la variazione di fluorescenza in ciascun miotubo.
Questo protocollo potrebbe essere utilizzato con successo per eliminare il gene RyR1 dai mioblasti umani, il che ha portato a un DNA genomico più corto nelle cellule. Il knock-out di RyR1 è stato confermato anche a livello proteico poiché la proteina RyR1 non poteva essere rilevata nelle cellule bersaglio mediante Western blotting. L'assenza di attività di RyR1 nei miotubi differenziati dalle cellule knock-out RyR1 è stata ulteriormente verificata mediante imaging del calcio Fluo-4 dopo stimolazione diretta RyR1 da 4CmC o stimolazione indiretta mediante depolarizzazione della membrana indotta da cloruro di potassio.
La sequenza che verrà eliminata dovrebbe essere necessaria per la previsione di una proteina funzionale. Questa tecnica è ideale per lo sviluppo di strumenti post-genomici per studiare il coinvolgimento di nuovi geni nella malattia muscolare.
