Bu protokol, bu genin kastaki işlevini daha fazla incelemek için herhangi bir gende kas hücresi nakavtının gelişmesine izin verir. Bunun avantajı, herhangi bir geni incelemek için nakavt hayvanların gelişiminden daha ucuz ve hızlı olmasıdır. Bu teknik, örneğin, yeni tanımlanmış bir genin bir miyopatiye katılımını incelemek için kullanılabilir.
Burada açıklanan teknik iPS hücrelerine uygulanırsa, herhangi bir hücre türündeki herhangi bir gen için nakavt hücrelerin gelişmesine yol açabilir. Kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlara veya CRISPR aracılı gen delesyonuna başlamak için, önce ensembl gibi genom tarayıcı araçlarını kullanın. Hedef geni, her iki tarafındaki DNA dizileri ile birlikte tanımlamak için organizasyon.
Gen ekzonlarının listesini almak için, önce protein kodlama dizisinin transkriptine ve ardından ekzonlara tıklayın. Ardından, Sırayı indir'e tıklayın ve tüm genin tam fikir birliği dizisini indirmek için yalnızca Genomik dizi'yi seçin. Hedeflenenleri seçmek için genin ekzonların ve intronlarının listesini kaydırın.
Kılavuz RNA'yı tasarlamak için, önce hedef dizinin hemen yukarı ve aşağı akış intronlarının nükleotid dizilerini seçin. Ardından crispr.tefor gibi bir web sitesine gidin. ağ ve seçilen dizileri, birkaç yüz baz çifti ile ayrılmış Protospacer Bitişik Motif olmadan her biri 20 nükleotid uzunluğunda iki kılavuz RNA tasarlamak için kullanın.
Daha sonra her kılavuz RNA için ters kompleman dizisini belirleyin ve primerleri sıralayın. Plazmid klonlaması için kılavuz RNA kasetleri oluşturmak için, önce metinde açıklanan tarif ve programı kullanarak bir dizi primer içeren bir PCR çalıştırın, ardından PCR ürünlerini Tris-borat-EDTA tamponunu kullanarak% 1 agaroz jelinde ayırın. Daha sonra 300 baz çift parçasını tüketin ve bir kit kullanarak saflaştırın.
Benzer şekilde, diğer astar seti ile başka bir PCR çalıştırdıktan sonra, 400 baz çifti uzunluğundaki DNA fragmanını 20 mikrolitre elüsyon tamponuna saflaştırın. Kılavuz RNA kasetlerini lentiviral plazmid omurgasına yerleştirmek için, önce metinde açıklandığı gibi Xma 1 ve Blp 1 kısıtlama enzimleri ile plazmidin çift sindirim reaksiyonunu ayarlayın. Reaksiyon tüpünü bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, 20 dakika boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin, ardından sindirim ürününü% 1'lik bir agaroz jeli içinde çalıştırın ve uygun bir kit kullanarak yaklaşık 10 kilobaz çiftinin plazmidini arındırın.
Ayrıca optik yoğunluğu ölçerek saflaştırılmış ürünü ölçün. Kılavuz RNA kasetini plazmidle bağlamak için, saflaştırılmış kılavuz RNA, doğrusallaştırılmış plazmid DNA'sı, enzim ve su ile 10 mikrolitrelik bir son hacme kadar bir reaksiyon karışımı hazırlayın, ardından reaksiyon tüpünü 15 dakika boyunca 50 santigrat derecede inkübe ederek pGuide adı verilen son plazmidi üretin. Lentivirüs üretimi için, ilk önce DMEM'de 1 milyon HEK 293 hücreli 145 santimetrelik bir plakayı,% 10 FBS ve% 1 penisilin veya streptomisin ile desteklenmiş yüksek glikoz ve piruvat ile tohumlayın.
Daha sonra hücreleri% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe üç gün boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Dördüncü günde,% 60 ila% 65 akıcılık sağlamak için hücreleri kontrol edin. Daha sonra ilgilenilen plazmid, virüs zarfını kodlayan plazmid, lentiviral ambalaj plazmidi psPAX2 ve kalsiyum fosfattan oluşan transfeksiyon çözeltisini hazırlayın.
Son ses seviyesini suyla 1000 mikrolitreye ayarlayın. Daha sonra transfeksiyon çözeltisini çalkalama altında bir mililitre 2X HBS'ye damla damla ekleyin ve oda sıcaklığında en az 10 dakika inkübe edin. Bundan sonra, çözeltiyi hücrelere damla damla ekleyin.
Transfeksiyon çözeltisinin homojen bir dağılımı için, plakayı yavaşça her yöne eğin, ardından hücreleri en az beş saat boyunca% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, ortamı plakalardan çıkarın ve transfeksiyon reaktiflerinden kurtulmak için hücreleri PBS ile yıkayın, ardından 12 mililitre taze ortam ekleyin. 37 santigrat derecede 48 saatlik inkübasyondan sonra, medyayı tüm plakalardan bir tüp halinde toplayın.
Tüpü kapalı bir kovaya koyun ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 800 kez G'de santrifüj yapın, ardından süpernatantı 0.45 mikrometrelik bir filtre kullanarak filtreleyin ve sallanan bir kova rotoru kullanarak filtratı dört santigrat derecede iki saat boyunca 68, 300 kez G'de santrifüj edin. Süper natantı çıkardıktan sonra, peletlerden maksimum sıvı uzaklaştırılması için tüpleri bir güvenlik dolabında bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı tutun. 100 mikrolitre HEC çoğalma ortamı ekleyin ve tüpleri en az iki saat boyunca dört santigrat derecede tutun.
Daha sonra pipetle pelet ile yeniden askıya alın. Tüm askıya alınmış peletleri topladıktan sonra, 10 veya 25 mikrolitrelik alikotlar yapın, ardından sıvı hidrojende dondurulduktan sonra alikotları eksi 80 santigrat derecede saklayın. Miyoblast transdüksiyonu için, ilk önce 10.000 miyoblast hücresi içeren 100 mikrolitre proliferasyon ortamı içeren 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna tohumlayın.
Ertesi gün, bir güvenlik kabinindeki hücrelere önceden hesaplanmış hacimlerde AG kılavuzları ve LV Cas9 ekleyin. Beş günlük inkübasyondan sonra, tripsin ekleyerek hücreleri kuyudan serbest bırakın. Hücre sayılarını saydıktan sonra, hücreleri% 40 ila% 50 akıcılığa sahip kuyulardan yeni bir plakaya aktarın.
Beş saatlik inkübasyondan sonra, 20 enfeksiyon çokluğunda hesaplanan LV öldürücü hacimlerini ekleyin ve beş ila 10 gün veya aralarında en az iki pasaj için kuluçkaya yatırın. Kalsiyum görüntüleme ile gen düzenlenmiş klonların fonksiyonel karakterizasyonu için, laminin kaplı 35 milimetrelik bir kabın merkezinde 50.000 hücre plakası. Farklılaştırmayı tetiklemek için, metinde açıklandığı gibi farklılaştırma ortamını ekleyin.
Altı günlük inkübasyondan sonra, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri hidrofobik bir kalemle tanımlayın. Daha sonra farklılaşmış miyotüplere farklılaşma ortamında bire bir seyreltilmiş 50 mikrolitre Fluo-4 Direct ekleyin. Bulaşıkları 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, hücreleri mililitre glikoz başına bir miligram ile desteklenmiş Krebs tamponu ile iki kez yıkayın.
Daha sonra, floresan varyasyonlarını 90 saniye boyunca saniyede bir kare hızında ölçmek ve en az 10 miyotüp içeren bir alan seçmek için ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu veya 10X hedefli bir konfokal mikroskop kullanın. Ek Krebs tamponunu çıkardıktan sonra, membran depolarizasyonu veya iki mililitre florokloral metakresol veya 4CmC veya RyR1 doğrudan stimülasyonu için hücreleri iki mililitre potasyum klorür ile uyarın. Stimülasyondan sonra floresan varyasyonunu görselleştirin, ardından her miyotüpteki floresan varyasyonunu ölçün.
Bu protokol, RyR1 genini insan miyoblastlarından nakavt etmek için başarıyla kullanılabilir ve bu da hücrelerde daha kısa genomik DNA ile sonuçlanır. RyR1 nakavtı, RyR1 proteininin hedeflenen hücrelerde Batı lekelenmesiyle tespit edilemediği için protein düzeyinde de doğrulandı. RyR1 nakavt hücrelerinden farklılaşan miyotüplerde RyR1 aktivitesinin yokluğu, 4CmC ile doğrudan RyR1 stimülasyonundan veya potasyum klorür kaynaklı membran depolarizasyonu ile dolaylı stimülasyondan sonra Fluo-4 kalsiyum görüntüleme ile daha da doğrulanmıştır.
Silinecek dizi, fonksiyonel bir proteinin tahmini için gerekli olmalıdır. Bu teknik, kas hastalığında yeni genin katılımını incelemek için post-genomik araçların geliştirilmesi için idealdir.
