이 프로토콜은 근육에서이 유전자의 기능을 더 연구하기 위해 모든 유전자에서 근육 세포 녹아웃의 개발을 허용합니다. 장점은 어떤 유전자를 연구하기 위해 녹아웃 동물의 개발보다 저렴하고 빠르다는 것입니다. 이 기술은 예를 들어, 근병증에서 새로 확인된 유전자의 관여를 연구하는데 사용될 수 있다.
여기에 기술된 기술이 iPS 세포에 적용된다면 임의의 유형의 세포에서 임의의 유전자에 대한 녹아웃 세포의 발달을 유도할 수 있다. 정기적으로 간격이 짧은 팰린드로믹 반복 또는 CRISPR 매개 유전자 결실을 시작하려면 먼저 앙상블과 같은 게놈 브라우저 도구를 사용하십시오. 조직(org)의 양쪽에 있는 DNA 서열과 함께 표적 유전자를 동정한다.
유전자 엑손의 목록을 얻으려면 먼저 단백질 코딩 서열의 전사체를 클릭 한 다음 Exons를 클릭하십시오. 그런 다음 다운로드 시퀀스를 클릭하고 게놈 시퀀스 만 선택하여 전체 유전자의 전체 합의 서열을 다운로드하십시오. 유전자의 엑손과 인트론 목록을 스크롤하여 표적화 된 것을 선택하십시오.
가이드 RNA를 설계하기 위해, 먼저 표적 서열의 바로 상류 및 하류의 인트론의 뉴클레오티드 서열을 선택한다. 그런 다음 crispr.tefor와 같은 웹 사이트로 이동하십시오. 그물 및 선택된 서열을 사용하여 두 개의 가이드 RNAs를 설계하고, 각각의 20개 뉴클레오티드는 수백 염기쌍으로 분리된 프로토스페이서 인접 모티프 없이 길다.
다음으로 각 가이드 RNA에 대한 역보체 서열을 확인하고 프라이머를 주문한다. 플라스미드 클로닝을 위한 가이드 RNA 카세트를 구성하려면 먼저 텍스트에 설명된 레시피 및 프로그램을 사용하여 프라이머 세트 1개로 PCR을 실행한 다음, Tris-borate-EDTA 버퍼를 사용하여 1% 아가로스 겔에서 PCR 산물을 분리합니다. 다음으로 300-염기 쌍 단편을 소비하고 키트를 사용하여 정제하십시오.
유사하게, 다른 프라이머 세트로 또 다른 PCR을 실행한 후, 400-염기쌍 긴 DNA 단편을 20 마이크로리터의 용출 완충액으로 정제한다. 가이드 RNA 카세트를 렌티바이러스 플라스미드 백본에 삽입하기 위해, 먼저 본문에 기재된 바와 같이 플라스미드와 제한 효소 Xma 1 및 Blp 1의 이중 소화 반응을 설정한다. 반응 튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 섭씨 65도에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 소화 생성물을 1% 아가로스 겔에서 실행하고 적절한 키트를 사용하여 약 10킬로염기쌍의 플라스미드를 정제한다.
또한 광학 밀도를 측정하여 정제된 생성물을 정량화한다. 가이드 RNA 카세트를 플라스미드와 리게이트하기 위해, 정제된 가이드 RNA, 선형화된 플라스미드 DNA, 효소 및 물과 10 마이크로리터의 최종 부피로 반응 믹스를 준비한 다음, 반응 튜브를 섭씨 50도에서 15분 동안 인큐베이션하여 pGuide라고 불리는 최종 플라스미드를 생성하였다. 렌티바이러스 생산을 위해, 먼저 10%FBS와 1%페니실린 또는 스트렙토마이신으로 보충된 고글루코스 및 피루베이트가 있는 DMEM에 1백만 HEK 293 세포가 있는 145센티미터 플레이트를 시드한다.
그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 배양기에서 3 일 동안 성장시킵니다. 넷째 날에는 세포를 검사하여 60 ~ 65 %의 합류율을 확인하십시오. 다음으로 관심있는 플라스미드, 바이러스 외피를 코딩하는 플라스미드, 렌티바이러스 패키징 플라스미드 psPAX2, 및 인산칼슘으로 구성된 형질감염 용액을 준비한다.
최종 부피를 물로 1000 마이크로 리터로 조정하십시오. 이어서, 형질감염 용액을 교반 하에 2X HBS의 1 밀리리터에 적가하고, 실온에서 적어도 10분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 용액을 세포에 적가하십시오.
형질감염 용액의 균질한 분포를 위해, 플레이트를 모든 방향으로 부드럽게 기울인 다음, 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 적어도 5시간 동안 인큐베이션한다. 다음으로, 플레이트로부터 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하여 형질감염 시약을 제거한 다음, 12 밀리리터의 신선한 배지를 첨가한다. 섭씨 37도에서 48시간 배양한 후, 모든 플레이트의 배지를 튜브에 풀링한다.
튜브를 밀봉된 버킷에 넣고 섭씨 4도에서 5분 동안 800배 G에서 원심분리한 다음, 0.45마이크로미터 필터를 이용하여 상층액을 여과한 후, 68, 300배 G에서 4°C에서 두 시간 동안 여과액을 원심분리하고, 스윙 버킷 로터를 사용한다. 상층액을 제거한 후 튜브를 안전 캐비닛의 종이 타월에 거꾸로 뒤집어 놓고 펠릿에서 액체를 최대한 제거하십시오. 100 마이크로 리터의 HEC 증식 배지를 넣고 튜브를 적어도 두 시간 동안 섭씨 네 도에서 유지하십시오.
그런 다음 피펫팅으로 펠렛을 재현탁하십시오. 재현탁 된 펠렛을 모두 수집 한 후 10 또는 25 마이크로 리터의 분취량을 만든 다음 액체 수소에서 스냅 동결 한 후 분취량을 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 근원세포 형질도입을 위해, 먼저 10, 000개의 근원세포 세포를 함유하는 100마이크로리터의 증식 배지로 96-웰 플레이트의 각 웰을 시드한다.
다음 날, 사전 계산된 LV 가이드와 LV Cas9 볼륨을 안전 캐비닛의 셀에 추가하십시오. 배양의 오일 후, 트립신을 첨가하여 웰에서 세포를 방출한다. 세포 번호를 세어 본 후 40 ~ 50 %의 합류율로 세포를 웰에서 새 플레이트로 옮깁니다.
다섯 시간의 인큐베이션 후, 20의 감염의 배수에서 LV 킬러의 계산 된 부피를 추가하고 5 ~ 10 일 또는 그 사이에 적어도 두 개의 계대 동안 배양하십시오. 칼슘 이미징에 의한 유전자 편집 클론의 기능적 특성화를 위해, 플레이트 50, 000 세포를 라미닌 코팅된 35-밀리미터 디쉬의 중앙에 위치시킨다. 분화를 유도하기 위해, 본문에 기재된 바와 같이 분화 배지를 첨가한다.
배양 엿새 후, 배양 배지를 벗고 소수성 펜으로 세포를 묘사한다. 그런 다음 분화 배지에서 일대일로 희석 된 Fluo-4 Direct 50 마이크로 리터를 분화 된 myotube에 첨가하십시오. 섭씨 37도에서 30 분 동안 접시를 배양 한 후, 포도당 밀리리터 당 한 밀리그램으로 보충 된 Krebs 버퍼로 세포를 두 번 씻으십시오.
다음으로 반전 형광 현미경 또는 10X 목표의 공초점 현미경을 사용하여 90 초 동안 초당 한 프레임의 속도로 형광 변화를 측정하고 적어도 10 개의 근관이있는 필드를 선택하십시오. 추가적인 크렙스 완충액을 제거한 후, 막 탈분극을 위해 2밀리리터의 염화칼륨 또는 2밀리리터의 플로로클로랄 메타크레졸 또는 4CmC 또는 RyR1 직접 자극으로 세포를 자극한다. 자극 후 형광 변화를 시각화한 다음, 각 myotube의 형광 변이를 정량한다.
이 프로토콜은 인간 근모세포로부터 RyR1 유전자를 녹아웃하는데 성공적으로 사용될 수 있었고, 이는 세포에서 게놈 DNA를 더 짧게 만들었다. RyR1 녹아웃은 또한 웨스턴 블롯팅에 의해 표적화된 세포에서 RyR1 단백질이 검출될 수 없었기 때문에 단백질 수준에서 확인되었다. RyR1 녹아웃 세포로부터 분화된 미오튜브에서 RyR1 활성의 부재는 4CmC에 의한 직접적인 RyR1 자극 또는 염화칼륨에 의한 간접 자극 후 Fluo-4 칼슘 이미징에 의해 추가로 검증되었다-유도된 막 탈분극.
결실될 서열은 기능적 단백질의 예측에 요구되어야 한다. 이 기술은 근육 질환에 새로운 유전자의 개입을 연구하기위한 게놈 후 도구의 개발에 이상적입니다.
