Dieses Protokoll ermöglicht die Entwicklung von Muskelzell-Knockout in jedem Gen, um die Funktion dieses Gens im Muskel weiter zu untersuchen. Der Vorteil ist, dass es billig und schneller als die Entwicklung von Knock-out-Tieren ist, jedes Gen zu untersuchen. Diese Technik kann beispielsweise verwendet werden, um die Beteiligung eines neu identifizierten Gens an einer Myopathie zu untersuchen.
Wenn die hier beschriebene Technik auf iPS-Zellen angewendet wird, kann dies zur Entwicklung von Knock-out-Zellen für jedes Gen in jeder Art von Zellen führen. Um mit geclusterten, regelmäßig interspaced kurzen palindromischen Wiederholungen oder CRISPR-vermittelter Gendeletion zu beginnen, verwenden Sie zunächst Genom-Browser-Tools wie ensembl. org, um das Zielgen zusammen mit den DNA-Sequenzen auf beiden Seiten zu identifizieren.
Um die Liste der Gen-Exons zu erhalten, klicken Sie zuerst auf das Transkript der Proteinkodierungssequenz und dann auf Exons. Klicken Sie anschließend auf Sequenz herunterladen und wählen Sie nur Genomische Sequenz, um die vollständige Konsenssequenz des gesamten Gens herunterzuladen. Scrollen Sie durch die Liste der Exons und Introns des Gens, um die Zielversionen auszuwählen.
Für das Design der Leit-RNA wählen Sie zunächst Nukleotidsequenzen der Introns unmittelbar vor und hinter der Zielsequenz aus. Dann gehen Sie zu einer Website wie crispr.tefor. und verwenden Sie die ausgewählten Sequenzen, um zwei Führungs-RNAs zu entwerfen, die jeweils 20 Nukleotide lang sind, ohne das Protospacer Adjacent Motif, getrennt durch einige hundert Basenpaare.
Als nächstes bestimmen Sie die umgekehrte Komplementsequenz für jede Führungs-RNA und ordnen Sie die Primer an. Um Guide-RNA-Kassetten für die Plasmidklonierung zu konstruieren, führen Sie zuerst eine PCR mit einem Satz Primer unter Verwendung des im Text beschriebenen Rezepts und Programms durch und trennen Sie dann die PCR-Produkte in 1% Agarosegel mit Tris-Borat-EDTA-Puffer. Als nächstes entfernen Sie das 300-Basenpaar-Fragment und reinigen Sie es mit einem Kit.
In ähnlicher Weise reinigen Sie nach dem Ausführen einer weiteren PCR mit dem anderen Primer-Set ein langes DNA-Fragment mit 400 Basen in 20 Mikroliter Elutionspuffer. Um die Leit-RNA-Kassetten in ein lentivirales Plasmid-Rückgrat einzuführen, wird zunächst eine doppelte Verdauungsreaktion des Plasmids mit den Restriktionsenzymen Xma1 und Blp 1 wie im Text beschrieben aufgebaut. Nachdem Sie das Reaktionsrohr bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubiert haben, inkubieren Sie es bei 65 Grad Celsius für 20 Minuten, lassen Sie dann das Verdauungsprodukt in einem 1% Agarose-Gel laufen und reinigen Sie das Plasmid von etwa 10 Kilobasenpaaren mit einem geeigneten Kit.
Quantifizieren Sie auch das gereinigte Produkt, indem Sie die optische Dichte messen. Um die Leit-RNA-Kassette mit dem Plasmid zu ligrieren, bereiten Sie eine Reaktionsmischung mit der gereinigten Leit-RNA, der linearisierten Plasmid-DNA, dem Enzym und dem Wasser auf ein Endvolumen von 10 Mikrolitern vor und inkubieren Sie dann das Reaktionsrohr bei 50 Grad Celsius für 15 Minuten, um das endgültige Plasmid zu erzeugen, das als pGuide bezeichnet wird. Für die Lentivirus-Produktion saatieren Sie zuerst eine 145-Zentimeter-Platte mit 1 Million HEK 293-Zellen in DMEM mit hoher Glukose und Pyruvat, ergänzt durch 10% FBS und 1% Penicillin oder Streptomycin.
Dann züchten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für drei Tage in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator. Überprüfen Sie am vierten Tag die Zellen, um eine Konfluenz von 60 bis 65% sicherzustellen. Als nächstes bereiten Sie die Transfektionslösung vor, die aus dem interessierenden Plasmid, dem Plasmid, das für die Virushülle kodiert, dem lentiviralen Verpackungsplasmid psPAX2 und Calciumphosphat besteht.
Stellen Sie das endgültige Volumen auf 1000 Mikroliter mit Wasser ein. Dann die Transfektionslösung tropfenweise auf einen Milliliter 2X HBS unter Rühren geben und bei Raumtemperatur für mindestens 10 Minuten inkubieren. Danach fügen Sie die Lösung dropwise zu den Zellen hinzu.
Für eine homogene Verteilung der Transfektionslösung neigen Sie die Platte vorsichtig in alle Richtungen und inkubieren Sie dann die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator für mindestens fünf Stunden. Als nächstes entfernen Sie das Medium von den Platten und waschen Sie die Zellen mit PBS, um die Transfektionsreagenzien loszuwerden, und fügen Sie dann 12 Milliliter frisches Medium hinzu. Nach 48 Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius die Medien aus allen Platten in einem Rohr zusammenführen.
Legen Sie das Rohr in einen versiegelten Eimer und zentrifugieren Sie bei 800 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, filtern Sie dann den Überstand mit einem 0,45-Mikrometer-Filter und zentrifugieren Sie das Filtrat bei 68, 300 mal G für zwei Stunden bei vier Grad Celsius mit einem schwingenden Eimerrotor. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, halten Sie die Schläuche fünf bis 10 Minuten lang auf einem Papiertuch in einem Sicherheitsschrank auf dem Kopf, um die Flüssigkeit aus den Pellets maximal zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter HEC-Proliferationsmedium hinzu und halten Sie die Röhrchen mindestens zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius.
Dann suspendieren Sie das Pellet durch Pipettieren. Nachdem Sie alle suspendierten Pellets gesammelt haben, machen Sie Aliquots von 10 oder 25 Mikrolitern und lagern Sie die Aliquots nach dem Einfrieren in flüssigem Wasserstoff bei minus 80 Grad Celsius. Für die Myoblastentransduktion bestücken Sie zuerst jedes Well einer 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern Proliferationsmedium, das 10.000 Myoblastenzellen enthält.
Fügen Sie am nächsten Tag vorberechnete Volumina von LV-Führungen und LV Cas9 zu den Zellen in einer Sicherheitswerkbank hinzu. Nach fünf Tagen Inkubation die Zellen aus dem Brunnen durch Zugabe von Trypsin freisetzen. Nachdem Sie die Zellzahlen gezählt haben, übertragen Sie die Zellen aus Vertiefungen mit 40 bis 50% Konfluenz auf eine neue Platte.
Fügen Sie nach fünf Stunden Inkubation berechnete Mengen an LV-Killer bei einer Vielzahl von Infektionen von 20 hinzu und inkubieren Sie für fünf bis 10 Tage oder mindestens zwei Passagen dazwischen. Zur funktionellen Charakterisierung der geneditierten Klone mittels Calcium-Imaging werden 50.000 Zellen in der Mitte einer lamininbeschichteten 35-Millimeter-Schale plattiert. Um eine Differenzierung zu induzieren, fügen Sie das Differenzierungsmedium wie im Text beschrieben hinzu.
Nehmen Sie nach sechs Tagen Inkubation das Kulturmedium ab und grenzen Sie die Zellen mit einem hydrophoben Pen ab. Dann fügen Sie 50 Mikroliter Fluo-4 Direct, verdünnt eins zu eins in Differenzierungsmedium, zu den differenzierten Myotuben hinzu. Nachdem Sie das Geschirr 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, waschen Sie die Zellen zweimal mit Krebspuffer, ergänzt mit einem Milligramm pro Milliliter Glukose.
Verwenden Sie als Nächstes ein inverses Fluoreszenzmikroskop oder ein konfokales Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv, um die Fluoreszenzvariationen mit einer Rate von einem Bild pro Sekunde für 90 Sekunden zu messen und wählen Sie ein Feld mit mindestens 10 Myoröhrchen. Nach dem Entfernen des zusätzlichen Krebspuffers stimulieren Sie die Zellen mit zwei Millilitern Kaliumchlorid zur Membrandepolarisation oder zwei Millilitern Florochloralmetakresol oder 4CmC oder RyR1 direkter Stimulation. Visualisieren Sie die Fluoreszenzvariation nach der Stimulation und quantifizieren Sie dann die Fluoreszenzvariation in jeder Myotube.
Dieses Protokoll konnte erfolgreich verwendet werden, um das Gen RyR1 aus menschlichen Myoblasten auszuschalten, was zu einer kürzeren genomischen DNA in den Zellen führte. RyR1-Knock-out wurde auch auf Proteinebene bestätigt, da das RyR1-Protein in den Zielzellen durch Western Blotting nicht nachgewiesen werden konnte. Das Fehlen von RyR1-Aktivität in Myotuben, die sich von den RyR1-Knock-out-Zellen unterschieden, wurde durch Fluo-4-Calcium-Bildgebung nach direkter RyR1-Stimulation durch 4CmC oder indirekter Stimulation durch Kaliumchlorid-induzierte Membrandepolarisation weiter verifiziert.
Die Sequenz, die gelöscht wird, sollte für die Vorhersage eines funktionellen Proteins erforderlich sein. Diese Technik ist ideal für die Entwicklung postgenomischer Werkzeuge, um die Beteiligung neuer Gene an Muskelerkrankungen zu untersuchen.
