Este protocolo demonstra que a combinação da transação do RNA mensageiro da sensação com medidas de impedância em tempo real da migração e invasão celular facilita a identificação de genes que estimulam a migração e invasão de células tumorais. O sistema de análise celular em tempo real baseado em impedância permite o monitoramento quantitativo, contínuo e abrangente da migração de células tumorais após alterações na expressão gênica. Genes que expressam tumores em excesso e estimulam a migração de células tumorais podem ser identificados como alvo potencial para inibir metástases na terapia do câncer.
Para começar, adicione 10 microlitros de tampão de reação 10x, 1,5 microlitros de PNE e 10 microgramas de DNA plasmidial a um tubo de microcentrífuga para linearizar o DNA plasmidial com a enzima de restrição. Adicione água livre de nuclease para trazer o volume de reação para 100 microlitros. Misture batendo e girando para baixo antes de incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius durante a noite.
Novamente, gire para baixo e adicione cinco microlitros de 10% SDS, e um microlitro de 20 miligramas por mililitro de proteína K de grau RNA à mistura de reação antes de misturá-la e girá-la para baixo. Após 30 minutos de incubação a 50 graus Celsius, adicionar dois microlitros cada de 10x tampão de transcrição, ATP, GTP, UTP, CTP e T7, e um micrograma de um DNA linearizado a um tubo de microcentrífuga para síntese de RNA polimerase T7. Adicione água livre de nuclease para trazer o volume de reação para 20 microlitros.
Após um spin down, incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius por duas horas para síntese de RNA. Em seguida, gire para baixo e adicione um microlitro de DNAs e toque antes de 15 minutos de incubação a 37 graus Celsius para remover o DNA modelo. Comece a precipitação de cloreto de lítio do RNA adicionando 10 microlitros de cloreto de lítio 7,5 molares à mistura de reação.
Depois de bater e girar, incube a mistura de reação a menos 20 graus Celsius por 30 minutos. Para tampar aqueça a amostra de RNA a 65 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, coloque-a no gelo para resfriamento. Em seguida, adicione os componentes de reação de tampa e misture tocando.
Gire e incube a mistura de reação a 37 graus Celsius por uma hora. Para rejeitos poli-A, gire a amostra e adicione os componentes da reação de rejeito poli-A. Em seguida, toque, gire para baixo e incube a mistura de reação a 37 graus Celsius por duas horas.
Para precipitação de cloreto de lítio e quantificação do mRNA sintético, adicionar 50 microlitros de cloreto de lítio 7,5 molares e realizar a precipitação de cloreto de lítio. Retire uma alíquota de caldo de gel ECM do congelador e mantenha-a no gelo. Diluir o gel de ECM de 10 miligramas por litro para uma concentração de trabalho misturando 990 microlitros de DMEM com 10 microlitros de gel de ECM em um tubo de microcentrífuga.
Misture por pipetagem suave. Adicionar 60 microlitros de gel de ECM diluído a cada um dos 16 poços da câmara superior da placa CIM. Coloque a câmara superior da placa CIM com a tampa da placa em uma folha plástica protetora dentro de uma incubadora de dióxido de carbono por aproximadamente quatro horas para formar uma camada de gel.
Para eletroporação, adicionar um mililitro de DPBS à suspensão de células tumorais em cada tubo. Toque na suspensão da célula e gire para baixo três vezes por 10 segundos. Retire o sobrenadante usando uma micropipeta.
Adicione 110 microlitros de tampão de ressuspensão R ao pellet celular para obter 0,1 milhão de células em 10 microlitros. Adicione mRNA sintético ao pellet celular para obter a concentração de 0,2 a 20 nanogramas por microlitro, dependendo do nível de expressão desejado. Misture e ressuspenda o pellet de células suavemente batendo no botão.
Em seguida, eletroporar 10 microlitros da suspensão celular com um sistema de eletroporação a 1.350 volts por 10 milissegundos com três pulsos de cada vez. Uma vez feito, transferir as células eletroporosas para um novo tubo de microcentrífuga com 1,1 mililitros de DMEM contendo 0,5% de SFB. Abra o programa de análise clicando duas vezes no ícone do software de análise de células em tempo real.
Depois de abrir a opção de configuração de padrão de experimento padrão, selecione a opção para executar três experimentos separadamente. Abra cada berço clicando na aba número. Em seguida, clique na guia de anotações do experimento.
Selecione a pasta e salve os dados inserindo o nome do experimento. Clique na guia layout e selecione quatro poços de cada vez para configurar os poços quádruplos duplicados para cada condição de tratamento. Insira as informações da amostra e clique em aplicar.
Clique na guia agendar e, em seguida, adicione uma etapa para configurar o modo de duas etapas das medições de impedância da célula. Em seguida, clique em aplicar para configurar a primeira etapa. Clique em adicionar uma etapa novamente e insira 10 minutos para o intervalo e 48 horas para a duração da migração e invasão.
Em seguida, clique em aplicar para configurar a segunda etapa. Uma hora antes da medição da impedância celular, adicionar 160 microlitros de DMEM contendo 10% de soro ou outros atrativos quimioterápicos aos poços da câmara inferior da placa CIM. Montar a câmara superior contendo os poços revestidos em gel de MEC para invasão ou poços não revestidos para migração com a câmara inferior.
Para o ensaio de migração celular, adicionar 50 microlitros de soro baixo aos orifícios da câmara superior da placa CIM. Coloque a placa CIM e o berço do sistema na incubadora de CO2. Clique na guia mensagem.
Uma vez que a conexão está bem, a mensagem é exibida, a placa CIM está pronta para o experimento. Pré-incubar a placa CIM montada na incubadora de dióxido de carbono por 30 a 60 minutos antes da análise celular em tempo real para aclimatar a placa CIM à condição de cultura. Para a leitura da linha de base, clique no botão Iniciar para cada suporte.
Quando a janela salvar como for exibida, salve o arquivo experimental para executar a leitura da linha de base. Para assentos celulares, retire a placa CIM do berço e coloque-a no armário de biossegurança no suporte da placa. Em seguida, adicione 100 microlitros de células eletroporosas contendo 100.000 células aos poços da câmara superior da placa CIM e deixe a placa CIM sob o gabinete de biossegurança por 30 minutos à temperatura ambiente.
Meça a impedância da célula movendo a placa CIM totalmente montada de volta para o respectivo berço. Comece a medição da impedância da célula para a segunda etapa clicando no botão de início do suporte e na guia de plotagem. Em seguida, clique no botão adicionar tudo e selecione as caixas de média e desvio padrão para visualizar os dados em tempo real.
A eletroporação de células de glioblastoma U 118 mg com concentrações variáveis de crack sintético um mRNA resultou em um aumento dependente da concentração em flag tagged crack uma proteína um dia após a transfecção. 0,2 e dois nanogramas por microlitro de mRNA levaram a uma expressão indetectável ou modesta da proteína exógena crack um. 20 nanogramas por microlitro de mRNA resultaram em um nível de expressão mais alto do que a proteína endógena crack um.
O ensaio de migração celular indicou que a eletroporação foi de 0,2 ou dois nanogramas por microlitro de crack um mRNA não afetou muito a migração celular. No entanto, a eletroporação com 20 nanogramas por microlitro de crack um mRNA levou a uma clara estimulação da migração celular com mais células migrando entre duas e 13 horas, revelando que a migração celular de glioblastoma foi estimulada pelo aumento no nível de proteína de crack um. A eletroporação com mRNA de L-crack sintético levou a uma expressão robusta da proteína flag tagged crack L um dia após a transfecção.
A invasão das células controle diminuiu com o aumento da concentração de proteínas da MEC. A fissura L sobre a expressão das células mostrou uma diminuição dependente da concentração do gel de MEC na invasão celular. A comparação entre o controle e o L da fissura sobre a expressão de células em diferentes concentrações de gel de MEC indicou que a superexpressão de L de trinca geralmente estimula a invasão celular através da camada de gel de MEC.
Os resultados também sugeriram que as duas populações celulares foram afetadas diferencialmente pelo aumento da concentração de gel de MEC em diferentes momentos. As células devem ser ressuspensas rapidamente, suavemente e completamente na eletroporação da bolha R ressuspensa, porque a longa incubação das células na bolha R ressuspensa torna as células insalubres. Células tumorais de migração rápida e lenta podem ser isoladas para caracterizar diferenças entre as duas populações celulares.
