פרוטוקול זה מדגים כי שילוב של העברת רנ"א שליח תחושה עם מדידות מבוססות עכבה בזמן אמת של נדידת תאים ופלישה מקלים על זיהוי גנים המעודדים נדידת תאים סרטניים ופלישה. מערכת ניתוח תאים בזמן אמת מבוססת עכבה מאפשרת ניטור כמותי, רציף ומקיף של נדידת תאי הגידול בעקבות שינויים בביטוי גנים. גנים המבטאים יתר על המידה גידולים ומעודדים נדידת תאי גידול יכולים להיות מזוהים כמטרה פוטנציאלית לעיכוב גרורות בטיפול בסרטן.
כדי להתחיל, הוסף 10 מיקרוליטר של חיץ תגובה 10x, 1.5 מיקרוליטר של PNE אחד, ו 10 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לצינור מיקרו צנטריפוגה כדי ליניאריזציה של DNA פלסמיד עם אנזים הגבלה. הוסף מים ללא נוקלאז כדי להביא את נפח התגובה ל -100 מיקרוליטר. ערבבו אותו על ידי הקשה וסחיטה לפני הדגירה על תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה.
שוב, סובבו למטה והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של 10% SDS, ומיקרוליטר אחד של 20 מיליגרם למיליליטר של פרוטאינאז K בדרגת RNA לתערובת התגובה לפני ערבוב וסיבוב כלפי מטה. לאחר 30 דקות של דגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס, יש להוסיף שני מיקרוליטרים כל אחד של מאגר שעתוק 10x, ATP, GTP, UTP, CTP ו-T7, ומיקרוגרם אחד של DNA ליניארי לצינור מיקרו-צנטריפוגה עבור סינתזת RNA בתיווך T7 RNA פולימראז. הוסף מים ללא נוקלאז כדי להביא את נפח התגובה ל -20 מיקרוליטר.
לאחר ספין, לדגור על תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עבור סינתזת RNA. לאחר מכן, סובבו למטה והוסיפו מיקרוליטר אחד של דנ"א והקישו לפני 15 דקות דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להסיר את הדנ"א של התבנית. התחל את משקעי הליתיום כלוריד של הרנ"א על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של 7.5 ליתיום כלוריד מולארי לתערובת התגובה.
לאחר הקשה וסחרור, יש לדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. למכסה, מחממים את דגימת הרנ"א בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן מניחים אותה על קרח לקירור. לאחר מכן, הוסף רכיבי תגובת מכסה וערבב על ידי הקשה.
סובבו מטה ודגרו על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. עבור poly-A tailing, סובב את הדגימה כלפי מטה והוסף את רכיבי תגובת הזנב poly-A. לאחר מכן טפחו, סובבו כלפי מטה ודגרו על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
עבור משקעים ליתיום כלורי וכימות של mRNA סינתטי, להוסיף 50 מיקרוליטר של 7.5 ליתיום כלוריד מולארי ולבצע את משקעי ליתיום כלוריד. הסר aliquot של ציר ג'ל ECM מהמקפיא ולשמור אותו על קרח. לדלל את 10 מיליגרם לליטר ג'ל ECM לריכוז עבודה על ידי ערבוב 990 מיקרוליטר של DMEM עם 10 מיקרוליטר של ג'ל ECM בצינור מיקרו צנטריפוגה.
מערבבים על ידי פיפטינג עדין. הוסף 60 מיקרוליטר של ג'ל ECM מדולל לכל אחת מ -16 הבארות של החדר העליון של צלחת CIM. הניחו את החדר העליון של צלחת CIM עם כיסוי הצלחת על יריעת פלסטיק מגנה בתוך אינקובטור פחמן דו חמצני למשך כארבע שעות ליצירת שכבת ג'ל.
עבור אלקטרופורציה, הוסף מיליליטר אחד של DPBS לתרחיף תאי הגידול בכל צינור. הקש על מתלה התא וסובב מטה שלוש פעמים למשך 10 שניות. מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת מיקרו פיפטה.
הוסף 110 מיקרוליטר של חיץ תרחיף R לכדורית התא כדי לקבל 0.1 מיליון תאים ב -10 מיקרוליטר. הוסף mRNA סינתטי לכדורית התא כדי לקבל ריכוז של 0.2 עד 20 ננוגרם למיקרוליטר בהתאם לרמת הביטוי הרצויה. ערבבו והשעו מחדש את כדורית התא בעדינות על ידי הקשה.
לאחר מכן, electroporate 10 מיקרוליטר של השעיית התא עם מערכת electroporation ב 1, 350 וולט במשך 10 אלפיות השנייה עם שלוש פעימות בכל פעם. לאחר שתסיים, העבר את התאים המחושלים לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש עם 1.1 מיליליטר DMEM המכיל 0.5% FBS. פתח את תוכנית הניתוח על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה לניתוח תאים בזמן אמת.
לאחר פתיחת אפשרות ברירת המחדל להגדרת תבנית ניסוי, בחר באפשרות להפעלת שלושה ניסויים בנפרד. פתח כל עריסה על ידי לחיצה על כרטיסיית המספרים. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסיה הערות ניסוי.
בחר בתיקייה ושמור את הנתונים על-ידי הזנת שם הניסוי. לחץ על כרטיסיית הפריסה ובחר ארבע בארות בכל פעם כדי להגדיר את ארבע הבארות הכפולות עבור כל תנאי טיפול. הזן את המידע לדוגמה ולחץ על החל.
לחץ על הכרטיסיה לוח זמנים ולאחר מכן הוסף שלב כדי להגדיר את המצב הדו-שלבי של מדידות עכבת התא. לאחר מכן, לחץ על החל כדי להגדיר את השלב הראשון. לחץ על הוסף שלב שוב והזן 10 דקות למרווח ו -48 שעות למשך ההגירה והפלישה.
לאחר מכן, לחץ על החל כדי להגדיר את השלב השני. שעה לפני מדידת עכבת התא, הוסף 160 מיקרוליטר DMEM המכיל 10% סרום או מושכי כימותרפיה אחרים לבארות של החדר התחתון של צלחת CIM. להרכיב את החדר העליון המכיל בארות מצופות ג'ל ECM לפלישה או בארות לא מצופות להגירה עם החדר התחתון.
לבדיקת נדידת תאים, הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום סרום נמוך לבארות של החדר העליון של צלחת CIM. מקם את צלחת CIM ואת עריסת המערכת באינקובטור CO2. לחץ על כרטיסיית ההודעה.
ברגע שהחיבור תקין, מוצגת הודעה, לוח CIM מוכן לניסוי. יש לדגור מראש על צלחת CIM שהורכבה באינקובטור הפחמן הדו-חמצני למשך 30 עד 60 דקות לפני ניתוח התאים בזמן אמת כדי להתאים את צלחת CIM למצב התרבית. לקריאת קו הבסיס, לחץ על לחצן התחל עבור כל עריסה.
כאשר החלון שמירה בשם מופיע, שמור את הקובץ הניסיוני כדי לבצע את קריאת קו הבסיס. להושבה בתאים, הסר את צלחת CIM מהעריסה והנח אותה בארון הבטיחות הביולוגית על מחזיק הצלחת. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תאים מחושמלים המכילים 100, 000 תאים לבארות של החדר העליון של צלחת CIM, והשאיר את צלחת CIM מתחת לארון הבטיחות הביולוגית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
מדוד את עכבת התא על-ידי הזזת לוח CIM שהורכב במלואו בחזרה לעריסה המתאימה. התחל את מדידת עכבת התא לשלב השני על ידי לחיצה על כפתור התחל העריסה ועל הכרטיסייה התוויית. לאחר מכן לחץ על הלחצן הוסף הכל ובחר את תיבות הממוצע וסטיית התקן כדי להמחיש את הנתונים בזמן אמת.
אלקטרופורציה של תאי גליובלסטומה U 118 מ"ג עם ריכוזים משתנים של קראק סינתטי mRNA אחד הביאה לעלייה תלוית ריכוז בקראק מסומן בחלבון אחד יום לאחר ההדבקה. 0.2 ושני ננוגרם למיקרוליטר mRNA הובילו לביטוי צנוע או בלתי ניתן לגילוי של הסדק האקסוגני חלבון אחד. 20 ננוגרם למיקרוליטר mRNA הביא לרמת ביטוי גבוהה יותר מאשר הקראק האנדוגני חלבון אחד.
בדיקת נדידת התאים הצביעה על כך שהאלקטרופורציה הייתה 0.2 או שני ננוגרם לכל סדק מיקרוליטר, mRNA אחד לא השפיע באופן משמעותי על נדידת תאים. עם זאת, אלקטרופורציה עם 20 ננוגרם לכל סדק מיקרוליטר mRNA אחד הובילה לגירוי ברור של נדידת תאים, כאשר תאים נוספים נדדו בין שעתיים ל -13 שעות וחשפו כי נדידת תאי גליובלסטומה עוררה על ידי העלייה בסדק ברמת חלבון אחד. האלקטרופורציה עם סדק סינתטי L mRNA הובילה לביטוי חזק של דגל מתויג סדק L חלבון יום לאחר טרנספקציה.
הפלישה של תאי הבקרה הואטה עם ריכוז חלבון ECM מוגבר. סדק L מעל תאים מבטאים הראה ירידה תלוית ריכוז ג'ל ECM בפלישת תאים. ההשוואה בין הבקרה לבין סדק L על פני תאים המבטאים תאים בריכוזי ג'ל ECM שונים הצביעה על כך שביטוי יתר של סדק L עורר בדרך כלל פלישה של תאים דרך שכבת הג'ל ECM.
התוצאות גם הצביעו על כך ששתי אוכלוסיות התאים הושפעו באופן דיפרנציאלי מעלייה בריכוז ג'ל ECM בנקודות זמן שונות. תאים צריכים להיות מושעים מחדש במהירות, בעדינות, ולחלוטין בבועה R מרחפת אנשים electroporation כי דגירה ארוכה של תאים בבועה R מרחף מחדש עושה תאים לא בריאים. ניתן לבודד תאי גידול נודדים במהירות ובאיטיות כדי לאפיין הבדלים בין שתי אוכלוסיות התאים.
