Ce protocole démontre que la combinaison de la transaction de l’ARN messager à sensation avec des mesures en temps réel de la migration et de l’invasion cellulaires basées sur l’impédance facilite l’identification des gènes qui stimulent la migration et l’invasion des cellules tumorales. Le système d’analyse cellulaire en temps réel basé sur l’impédance permet une surveillance quantitative, continue et complète de la migration des cellules tumorales lors des changements d’expression génique. Les gènes qui surexpriment les tumeurs et stimulent la migration des cellules tumorales peuvent être identifiés comme une cible potentielle pour inhiber les métastases dans le traitement du cancer.
Pour commencer, ajoutez 10 microlitres de tampon de réaction 10x, 1,5 microlitre de PNE One et 10 microgrammes d’ADN plasmidique dans un tube de micro-centrifugation pour linéariser l’ADN plasmidique avec l’enzyme de restriction. Ajoutez de l’eau sans nucléase pour porter le volume de réaction à 100 microlitres. Mélangez-le en le tapotant et en le faisant tourner avant d’incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Encore une fois, faites tourner vers le bas et ajoutez cinq microlitres de SDS à 10 % et un microlitre de 20 milligrammes par millilitre de protéinase K de qualité ARN au mélange réactionnel avant de le mélanger et de le faire tourner. Après 30 minutes d’incubation à 50 degrés Celsius, ajoutez deux microlitres chacun de tampon de transcription 10x, ATP, GTP, UTP, CTP et T7, et un microgramme d’ADN linéarisé dans un tube à micro-centrifuger pour la synthèse de l’ARN médiée par l’ARN polymérase T7. Ajoutez de l’eau sans nucléase pour porter le volume de réaction à 20 microlitres.
Après un essorage, incubez le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour la synthèse de l’ARN. Ensuite, faites tourner vers le bas et ajoutez un microlitre d’ADN et tapotez avant 15 minutes d’incubation à 37 degrés Celsius pour éliminer l’ADN modèle. Commencez la précipitation du chlorure de lithium de l’ARN en ajoutant 10 microlitres de chlorure de lithium à 7,5 molaires au mélange réactionnel.
Après avoir tapoté et essoré, incuber le mélange réactionnel à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour le bouchage, chauffez l’échantillon d’ARN à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis placez-le sur de la glace pour le refroidir. Ensuite, ajoutez les composants de la réaction de bouchage et mélangez en tapotant.
Essorez et incubez le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant une heure. Dans le cas d’un résidu poly-A, faites tourner l’échantillon vers le bas et ajoutez les composants de la réaction du résidant poly-A. Ensuite, tapotez, essorez et incubez le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant deux heures.
Pour la précipitation du chlorure de lithium et la quantification de l’ARNm synthétique, ajoutez 50 microlitres de chlorure de lithium à 7,5 molaires et effectuez la précipitation du chlorure de lithium. Sortez une aliquote de gel ECM du congélateur et conservez-la sur de la glace. Diluez les 10 milligrammes par litre de gel ECM à une concentration de travail en mélangeant 990 microlitres de DMEM avec 10 microlitres de gel ECM dans un tube de micro-centrifugation.
Mélanger par pipetage doux. Ajouter 60 microlitres de gel ECM dilué dans chacun des 16 puits de la chambre supérieure de la plaque CIM. Placez la chambre supérieure de la plaque CIM avec le couvercle de la plaque sur une feuille de plastique protectrice à l’intérieur d’un incubateur à dioxyde de carbone pendant environ quatre heures pour former une couche de gel.
Pour l’électroporation, ajoutez un millilitre de DPBS à la suspension de cellules tumorales dans chaque tube. Tapotez la suspension cellulaire et tournez vers le bas trois fois pendant 10 secondes. Retirer le surnageant à l’aide d’une micro pipette.
Ajouter 110 microlitres de tampon de remise en suspension R à la pastille cellulaire pour obtenir 0,1 million de cellules dans 10 microlitres. Ajoutez de l’ARNm synthétique à la pastille cellulaire pour obtenir la concentration de 0,2 à 20 nanogrammes par microlitre en fonction du niveau d’expression souhaité. Mélangez et remettez doucement en suspension la pastille cellulaire en tapotant.
Ensuite, électroporez 10 microlitres de la suspension cellulaire avec un système d’électroporation à 1 350 volts pendant 10 millisecondes avec trois impulsions à chaque fois. Une fois cela fait, transférez les cellules électroporées dans un nouveau tube de micro-centrifugation avec 1,1 millilitre de DMEM contenant 0,5% FBS. Ouvrez le programme d’analyse en double-cliquant sur l’icône du logiciel d’analyse cellulaire en temps réel.
Après avoir ouvert l’option de configuration du modèle de test par défaut, sélectionnez l’option permettant d’exécuter trois tests séparément. Ouvrez chaque berceau en cliquant sur l’onglet numéro. Ensuite, cliquez sur l’onglet Notes du test.
Sélectionnez le dossier et enregistrez les données en saisissant le nom de l’expérience. Cliquez sur l’onglet Disposition et sélectionnez quatre puits à la fois pour configurer les quatre puits en double pour chaque condition de traitement. Entrez les informations de l’échantillon et cliquez sur appliquer.
Cliquez sur l’onglet Planification, puis ajoutez une étape pour configurer le mode en deux étapes des mesures d’impédance des cellules. Cliquez ensuite sur Appliquer pour configurer la première étape. Cliquez à nouveau sur ajouter une étape et entrez 10 minutes pour l’intervalle et 48 heures pour la durée de la migration et de l’invasion.
Ensuite, cliquez sur appliquer pour mettre en place la deuxième étape. Une heure avant la mesure de l’impédance cellulaire, ajoutez 160 microlitres de DMEM contenant 10 % de sérum ou d’autres attractifs de chimiothérapie dans les puits de la chambre inférieure de la plaque CIM. Assemblez la chambre supérieure contenant les puits revêtus de gel ECM pour l’invasion ou les puits non revêtus pour la migration avec la chambre inférieure.
Pour le test de migration cellulaire, ajouter 50 microlitres de milieu sérique bas dans les puits de la chambre supérieure de la plaque CIM. Placez la plaque CIM et le berceau du système dans l’incubateur à CO2. Cliquez sur l’onglet message.
Une fois que la connexion est correcte, le message s’affiche, la plaque CIM est prête pour l’expérience. Pré-incuber la plaque CIM assemblée dans l’incubateur de dioxyde de carbone pendant 30 à 60 minutes avant l’analyse cellulaire en temps réel pour acclimater la plaque CIM aux conditions de culture. Pour la lecture de la ligne de base, cliquez sur le bouton de démarrage de chaque station d’accueil.
Lorsque la fenêtre Enregistrer sous s’affiche, enregistrez le fichier expérimental pour effectuer la lecture de référence. Pour l’assise des cellules, retirez la plaque CIM du berceau et placez-la dans l’enceinte de sécurité biologique sur le support de plaque. Ajoutez ensuite 100 microlitres de cellules électroporées contenant 100 000 cellules dans les puits de la chambre supérieure de la plaque CIM, et laissez la plaque CIM sous l’enceinte de sécurité biologique pendant 30 minutes à température ambiante.
Mesurez l’impédance de la cellule en déplaçant la plaque CIM entièrement assemblée vers le berceau respectif. Commencez la mesure de l’impédance de la cellule pour la deuxième étape en cliquant sur le bouton de démarrage de la station d’accueil et sur l’onglet tracé. Cliquez ensuite sur le bouton Ajouter tout et cochez les cases Moyenne et Écart type pour visualiser les données en temps réel.
L’électroporation de cellules de glioblastome U 118 mg avec des concentrations variables d’ARNm synthétique crack one a entraîné une augmentation dépendante de la concentration de la protéine Flag Crack One marquée un jour après la transfection. 0,2 et deux nanogrammes par microlitre d’ARNm ont conduit à une expression indétectable ou modeste de la protéine exogène crack one. 20 nanogrammes par microlitre d’ARNm ont entraîné un niveau d’expression plus élevé que la protéine endogène crack one.
Le test de migration cellulaire a indiqué que l’électroporation était de 0,2 ou deux nanogrammes par microlitre de fissure, un ARNm n’affectait pas beaucoup la migration cellulaire. Cependant, l’électroporation avec 20 nanogrammes par microlitre d’ARNm a conduit à une stimulation claire de la migration cellulaire, avec plus de cellules migrant entre deux et 13 heures, révélant que la migration des cellules de glioblastome était stimulée par l’augmentation du niveau de protéine de crack one. L’électroporation avec de l’ARNm synthétique de crack L a conduit à une expression robuste de la protéine Crack L marquée par drapeau un jour après la transfection.
L’invasion des cellules témoins a ralenti avec l’augmentation de la concentration en protéines ECM. La fissure L sur les cellules exprimant a montré une diminution de l’invasion cellulaire dépendante de la concentration de gel ECM. La comparaison entre le contrôle et la fissure L sur les cellules exprimant à différentes concentrations de gel ECM a indiqué que la surexpression de la fissure L stimulait généralement l’invasion cellulaire à travers la couche de gel ECM.
Les résultats ont également suggéré que les deux populations cellulaires étaient affectées différemment par l’augmentation de la concentration de gel ECM à différents moments. Les cellules doivent être remises en suspension rapidement, doucement et complètement dans la bulle R remise en suspension par électroporation des personnes, car une longue incubation des cellules dans la bulle R remise en suspension rend les cellules malsaines. Les cellules tumorales à migration rapide et lente peuvent être isolées pour caractériser les différences entre les deux populations cellulaires.
