Este protocolo demuestra que la combinación de la transacción de ARN mensajero de sensación con mediciones en tiempo real basadas en impedancia de la migración e invasión celular facilita la identificación de genes que estimulan la migración e invasión de células tumorales. El sistema de análisis celular en tiempo real basado en impedancia permite un monitoreo cuantitativo, continuo y completo de la migración de células tumorales tras cambios en la expresión génica. Los genes que sobreexpresan tumores y estimulan la migración de células tumorales pueden identificarse como una diana potencial para inhibir la metástasis en el tratamiento del cáncer.
Para comenzar, agregue 10 microlitros de tampón de reacción 10x, 1,5 microlitros de PNE uno y 10 microgramos de ADN plasmídico a un tubo de microcentrífuga para linealizar el ADN plasmídico con la enzima de restricción. Agregue agua libre de nucleasa para llevar el volumen de reacción a 100 microlitros. Mézclalo golpeándolo y girándolo hacia abajo antes de incubar la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante la noche.
Nuevamente, gire hacia abajo y agregue cinco microlitros de SDS al 10% y un microlitro de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K de grado de ARN a la mezcla de reacción antes de mezclarla y girarla. Después de 30 minutos de incubación a 50 grados centígrados, agregue dos microlitros de cada uno de los tampones de transcripción 10x, ATP, GTP, UTP, CTP y T7, y un microgramo de un ADN linealizado a un tubo de microcentrífuga para la síntesis de ARN polimerasa T7. Agregue agua libre de nucleasas para llevar el volumen de reacción a 20 microlitros.
Después de un centrifugado, incube la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante dos horas para la síntesis de ARN. A continuación, gire hacia abajo y agregue un microlitro de ADN y golpee antes de 15 minutos de incubación a 37 grados centígrados para eliminar el ADN molde. Comience la precipitación de cloruro de litio del ARN agregando 10 microlitros de cloruro de litio 7.5 molar a la mezcla de reacción.
Después de golpear y girar, incube la mezcla de reacción a menos 20 grados centígrados durante 30 minutos. Para taponar, caliente la muestra de ARN a 65 grados centígrados durante 10 minutos y luego colóquela en hielo para que se enfríe. A continuación, agregue los componentes de la reacción de tapado y mezcle golpeando.
Centrifugar e incubar la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante una hora. Para el relojo de poli-A, gire la muestra hacia abajo y agregue los componentes de la reacción de relaves de poli-A. A continuación, golpee, gire e incube la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante dos horas.
Para la precipitación de cloruro de litio y la cuantificación del ARNm sintético, agregue 50 microlitros de cloruro de litio de 7,5 molares y realice la precipitación de cloruro de litio. Retire una alícuota de caldo de gel ECM del congelador y manténgala en hielo. Diluya los 10 miligramos por litro de gel de ECM hasta una concentración de trabajo mezclando 990 microlitros de DMEM con 10 microlitros de gel de ECM en un tubo de microcentrífuga.
Mezclar mediante un pipeteo suave. Agregue 60 microlitros de gel de ECM diluido a cada uno de los 16 pocillos de la cámara superior de la placa CIM. Coloque la cámara superior de la placa CIM sin la cubierta de la placa sobre una lámina protectora de plástico dentro de una incubadora de dióxido de carbono durante aproximadamente cuatro horas para formar una capa de gel.
Para la electroporación, agregue un mililitro de DPBS a la suspensión de células tumorales en cada tubo. Toque la suspensión de la celda y gire hacia abajo tres veces durante 10 segundos. Retire el sobrenadante con una micropipeta.
Agregue 110 microlitros de tampón de resuspensión R al gránulo de celda para obtener 0,1 millones de células en 10 microlitros. Agregue ARNm sintético al gránulo celular para obtener la concentración de 0,2 a 20 nanogramos por microlitro dependiendo del nivel de expresión deseado. Mezcle y vuelva a suspender el gránulo celular suavemente golpeando.
A continuación, electropore 10 microlitros de la suspensión de la celda con un sistema de electroporación a 1.350 voltios durante 10 milisegundos con tres pulsos cada vez. Una vez hecho esto, transfiera las celdas electroporadas a un nuevo tubo de microcentrífuga con 1,1 mililitros de DMEM que contenga 0,5% de FBS. Abra el programa de análisis haciendo doble clic en el icono del software de análisis de celdas en tiempo real.
Después de abrir la opción de configuración predeterminada del patrón de experimento, seleccione la opción para ejecutar tres experimentos por separado. Abra cada base haciendo clic en la pestaña de números. A continuación, haga clic en la pestaña Notas del experimento.
Seleccione la carpeta y guarde los datos escribiendo el nombre del experimento. Haga clic en la pestaña de diseño y seleccione cuatro pocillos a la vez para configurar los pocillos duplicados cuádruples para cada condición de tratamiento. Ingrese la información de la muestra y haga clic en aplicar.
Haga clic en la pestaña de programación y, a continuación, añada un paso para configurar el modo de dos pasos de las mediciones de impedancia de la celda. A continuación, haga clic en aplicar para configurar el primer paso. Haga clic en agregar un paso nuevamente e ingrese 10 minutos para el intervalo y 48 horas para la duración de la migración y la invasión.
A continuación, haz clic en aplicar para configurar el segundo paso. Una hora antes de la medición de la impedancia celular, agregue 160 microlitros de DMEM que contengan 10% de suero u otros atrayentes de quimioterapia a los pocillos de la cámara inferior de la placa CIM. Ensamble la cámara superior que contiene los pocillos recubiertos de gel ECM para la invasión o los pocillos no recubiertos para la migración con la cámara inferior.
Para el ensayo de migración celular, agregue 50 microlitros de medio sérico bajo a los pocillos de la cámara superior de la placa CIM. Coloque la placa CIM y la base del sistema en la incubadora de CO2. Haga clic en la pestaña de mensajes.
Una vez que la conexión está bien, se muestra el mensaje, la placa CIM está lista para el experimento. Preincube la placa CIM ensamblada en la incubadora de dióxido de carbono durante 30 a 60 minutos antes del análisis celular en tiempo real para aclimatar la placa CIM a la condición de cultivo. Para la lectura de referencia, haga clic en el botón de inicio de cada base.
Cuando aparezca la ventana Guardar como, guarde el archivo experimental para realizar la lectura de la línea base. Para el asiento de las células, retire la placa CIM de la base y colóquela en el gabinete de bioseguridad sobre el soporte de la placa. A continuación, añada 100 microlitros de células electroporadas que contengan 100.000 células a los pocillos de la cámara superior de la placa CIM, y deje la placa CIM debajo de la cabina de bioseguridad durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Mida la impedancia de la celda moviendo la placa CIM completamente ensamblada de regreso a la base respectiva. Comience la medición de la impedancia de la celda para el segundo paso haciendo clic en el botón de inicio de la base y en la pestaña de trazado. A continuación, haga clic en el botón Agregar todo y seleccione las casillas de promedio y desviación estándar para visualizar los datos en tiempo real.
La electroporación de células de glioblastoma U 118 mg con concentraciones variables de ARNm sintético de crack one dio lugar a un aumento dependiente de la concentración de la proteína de crack uno marcada con bandera un día después de la transfección. 0,2 y dos nanogramos por microlitro de ARNm condujeron a una expresión indetectable o modesta de la proteína exógena crack one. 20 nanogramos por microlitro de ARNm dieron como resultado un nivel de expresión más alto que la proteína endógena crack uno.
El ensayo de migración celular indicó que la electroporación fue de 0,2 o dos nanogramos por grieta de microlitro, un ARNm no afectó en gran medida la migración celular. Sin embargo, la electroporación con 20 nanogramos por microlitro de ARNm condujo a una clara estimulación de la migración celular con más células migrando entre dos y 13 horas, lo que revela que la migración celular del glioblastoma fue estimulada por el aumento en el nivel de proteína de la grieta uno. La electroporación con ARNm de crack L sintético condujo a una expresión robusta de la proteína L de crack marcada con bandera un día después de la transfección.
La invasión de las células de control se ralentizó con el aumento de la concentración de proteínas de la MEC. La grieta L sobreexpresada mostró una disminución de la invasión celular dependiente de la concentración de gel de ECM. La comparación entre las células de control y las células de sobreexpresión de crack L a diferentes concentraciones de gel de ECM indicó que la sobreexpresión de crack L generalmente estimuló la invasión celular a través de la capa de gel de ECM.
Los resultados también sugirieron que las dos poblaciones celulares se vieron afectadas de manera diferencial por el aumento de la concentración de gel de MEC en diferentes puntos de tiempo. Las células deben resuspenderse de forma rápida, suave y completa en la burbuja resuspendida R personas electroporadas porque la incubación prolongada de las células en la burbuja R resuspendida hace que las células no sean saludables. Las células tumorales de migración rápida y lenta se pueden aislar para caracterizar las diferencias entre las dos poblaciones celulares.
