Bu protokol, duyum haberci RNA işleminin, hücre göçü ve invazyonunun empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümleri ile birleştirilmesinin, tümör hücresi göçünü ve invazyonunu uyaran genin tanımlanmasını kolaylaştırdığını göstermektedir. Empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analiz sistemi, gen ekspresyonu değişiklikleri üzerine tümör hücresi göçünün nicel, sürekli ve kapsamlı bir şekilde izlenmesini sağlar. Tümörleri aşırı eksprese eden ve tümör hücresi göçünü uyaran genler, kanser tedavisinde metastazı inhibe etmek için potansiyel hedef olarak tanımlanabilir.
Başlamak için, plazmit DNA'yı kısıtlama enzimi ile doğrusallaştırmak için bir mikro santrifüj tüpüne 10 mikrolitre 10x reaksiyon tamponu, 1.5 mikrolitre PNE bir ve 10 mikrogram plazmit DNA ekleyin. Reaksiyon hacmini 100 mikrolitreye çıkarmak için nükleaz içermeyen su ekleyin. Reaksiyon karışımını gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeden önce hafifçe vurarak ve döndürerek karıştırın.
Yine, karıştırmadan ve döndürmeden önce reaksiyon karışımına beş mikrolitre% 10 SDS ve mililitre başına 20 miligram bir mikrolitre RNA dereceli proteinaz K ekleyin. 50 santigrat derecede 30 dakikalık inkübasyondan sonra, T7 RNA polimeraz aracılı RNA sentezi için bir mikro santrifüj tüpüne her biri 10x transkripsiyon tamponu, ATP, GTP, UTP, CTP ve T7'nin her biri iki mikrolitre ve bir mikrogram doğrusallaştırılmış DNA ekleyin. Reaksiyon hacmini 20 mikrolitreye çıkarmak için nükleaz içermeyen su ekleyin.
Bir döndürmeden sonra, reaksiyon karışımını RNA sentezi için iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, döndürün ve bir mikrolitre DNA ekleyin ve şablon DNA'yı çıkarmak için 37 santigrat derecede 15 dakikalık inkübasyondan önce hafifçe vurun. Reaksiyon karışımına 10 mikrolitre 7.5 molar lityum klorür ekleyerek RNA'nın lityum klorür çökelmesine başlayın.
Hafifçe vurup döndürdükten sonra, reaksiyon karışımını eksi 20 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Kapatmak için, RNA örneğini 65 santigrat derecede 10 dakika ısıtın ve ardından soğuması için buzun üzerine koyun. Ardından, kapatma reaksiyonu bileşenlerini ekleyin ve dokunarak karıştırın.
Reaksiyon karışımını döndürün ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Poli-A kuyruğu için, numuneyi döndürün ve poli-A kuyruğu reaksiyonu bileşenlerini ekleyin. Ardından dokunun, döndürün ve reaksiyon karışımını 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin.
Lityum klorür çökeltmesi ve sentetik mRNA'nın miktar tayini için 50 mikrolitre 7.5 molar lityum klorür ekleyin ve lityum klorür çökeltmesini gerçekleştirin. Dondurucudan bir miktar ECM jel stoğu çıkarın ve buz üzerinde tutun. Bir mikro santrifüj tüpünde 990 mikrolitre DMEM'i 10 mikrolitre ECM jeli ile karıştırarak litre başına 10 miligram ECM jelini çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
Nazik pipetleme ile karıştırın. CIM plakasının üst odasının 16 oyuğunun her birine 60 mikrolitre seyreltilmiş ECM jeli ekleyin. CIM plakasının üst haznesini, plaka kapağı kapalı olacak şekilde, bir jel tabakası oluşturmak için yaklaşık dört saat boyunca bir karbondioksit inkübatörü içindeki koruyucu plastik bir tabaka üzerine yerleştirin.
Elektroporasyon için, her tüpteki tümör hücresi süspansiyonuna bir mililitre DPBS ekleyin. Hücre askıya alınmasına dokunun ve 10 saniye boyunca üç kez döndürün. Bir mikro pipet kullanarak süpernatanı çıkarın.
10 mikrolitrede 0.1 milyon hücre elde etmek için hücre peletine 110 mikrolitre yeniden süspansiyon tamponu R ekleyin. İstenen ekspresyon seviyesine bağlı olarak mikrolitre başına 0.2 ila 20 nanogram konsantrasyon elde etmek için hücre peletine sentetik mRNA ekleyin. Hücre peletini hafifçe vurarak karıştırın ve yeniden süspanse edin.
Daha sonra, hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini, her seferinde üç darbeyle 10 milisaniye boyunca 1.350 voltta bir elektroporasyon sistemi ile elektroporasyon yapın. Tamamlandığında, elektroporasyonlu hücreleri% 0.5 FBS içeren 1.1 mililitre DMEM içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Gerçek zamanlı hücre analiz yazılımı simgesine çift tıklayarak analiz programını açın.
Varsayılan deneme modeli kurulumu seçeneğini açtıktan sonra, üç denemeyi ayrı ayrı çalıştırma seçeneğini belirleyin. Sayı sekmesine tıklayarak her bir yuvayı açın. Ardından, deneme notları sekmesini tıklayın.
Klasörü seçin ve denemenin adını girerek verileri kaydedin. Düzen sekmesine tıklayın ve her tedavi koşulu için dörtlü yinelenen kuyuları ayarlamak için bir seferde dört kuyu seçin. Örnek bilgileri girin ve uygula'ya tıklayın.
Program sekmesine tıklayın, ardından hücre empedans ölçümlerinin iki adımlı modunu ayarlamak için bir adım ekleyin. Ardından, ilk adımı ayarlamak için uygula'yı tıklayın. Tekrar bir adım ekle'ye tıklayın ve aralık için 10 dakika ve geçiş ve istila süresi için 48 saat girin.
Ardından, ikinci adımı ayarlamak için uygula'ya tıklayın. Hücre empedans ölçümünden bir saat önce, CIM plakasının alt odasının kuyucuklarına% 10 serum veya diğer kemoterapi cezbedici maddeler içeren 160 mikrolitre DMEM ekleyin. İstila için ECM jel kaplı kuyucukları içeren üst bölmeyi veya alt bölme ile migrasyon için kaplanmamış kuyuları monte edin.
Hücre migrasyon tahlili için, CIM plakasının üst odasının kuyucuklarına 50 mikrolitre düşük serum ortamı ekleyin. CIM plakasını ve sistemin kızağını CO2 inkübatörüne yerleştirin. Mesaj sekmesine tıklayın.
Bağlantı tamam olduğunda, CIM plakası deney için hazırdır. CIM plakasını kültür durumuna alıştırmak için gerçek zamanlı hücre analizinden önce monte edilmiş CIM plakasını karbondioksit inkübatöründe 30 ila 60 dakika önceden inkübe edin. Temel okuma için, her kızak için başlat düğmesine tıklayın.
Farklı kaydet penceresi görüntülendiğinde, temel okumayı gerçekleştirmek için deneysel dosyayı kaydedin. Hücre yerleşimi için, CIM plakasını yuvadan çıkarın ve plaka tutucudaki biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Daha sonra, CIM plakasının üst odasının kuyucuklarına 100.000 hücre içeren 100 mikrolitre elektroporasyonlu hücre ekleyin ve CIM plakasını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca biyogüvenlik kabininin altında bırakın.
Tamamen monte edilmiş CIM plakasını ilgili kızağa geri hareket ettirerek hücre empedansını ölçün. Beşik başlatma düğmesine ve çizim sekmesine tıklayarak ikinci adım için hücre empedansı ölçümüne başlayın. Ardından tümünü ekle düğmesine basın ve verileri gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için ortalama ve standart sapma kutularını seçin.
U 118 mg glioblastoma hücrelerinin değişen konsantrasyonlarda sentetik çatlak bir mRNA ile elektroporasyonu, transfeksiyondan bir gün sonra bayrak etiketli çatlak bir proteinde konsantrasyona bağlı bir artışa neden oldu. Mikrolitre mRNA başına 0.2 ve iki nanogram, eksojen çatlak bir proteinin tespit edilemeyen veya mütevazı bir ekspresyonuna yol açtı. Mikrolitre mRNA başına 20 nanogram, endojen çatlak bir proteinden daha yüksek bir ekspresyon seviyesi ile sonuçlandı.
Hücre göçü testi, elektroporasyonun mikrolitre çatlak başına 0.2 veya iki nanogram olduğunu, bir mRNA'nın hücre göçünü büyük ölçüde etkilemediğini gösterdi. Bununla birlikte, mikrolitre çatlak başına 20 nanogram bir mRNA ile elektroporasyon, iki ila 13 saat arasında daha fazla hücrenin göç etmesiyle hücre göçünün net bir şekilde uyarılmasına yol açtı ve glioblastoma hücre göçünün, çatlak bir protein seviyesindeki artışla uyarıldığını ortaya çıkardı. Sentetik çatlak L mRNA ile elektroporasyon, transfeksiyondan bir gün sonra bayrak etiketli çatlak L proteininin sağlam bir ekspresyonuna yol açtı.
Kontrol hücrelerinin istilası, artan ECM protein konsantrasyonu ile yavaşladı. Eksprese eden hücreler üzerindeki çatlak L, hücre invazyonunda ECM jel konsantrasyonuna bağlı bir azalma gösterdi. Farklı ECM jel konsantrasyonlarında eksprese eden hücreler üzerindeki kontrol ve çatlak L arasındaki karşılaştırma, çatlak L aşırı ekspresyonunun genellikle ECM jel tabakası boyunca hücre invazyonunu uyardığını gösterdi.
Sonuçlar ayrıca, iki hücre popülasyonunun, farklı zaman noktalarında artan ECM jel konsantrasyonundan farklı şekilde etkilendiğini göstermiştir. Hücreler, yeniden süspanse edilmiş R kabarcığı insan elektroporasyonunda hızlı, nazikçe ve tamamen yeniden süspanse edilmelidir, çünkü yeniden süspanse edilmiş R kabarcığındaki hücrelerin uzun süre inkübasyonu hücreleri sağlıksız hale getirir. Hızlı ve yavaş göç eden tümör hücreleri, iki hücre popülasyonu arasındaki farklılıkları karakterize etmek için izole edilebilir.
