이 프로토콜은 감각 메신저 RNA 트랜잭션과 임피던스 기반 세포 이동 및 침습 실시간 측정을 결합하면 종양 세포 이동 및 침입을 자극하는 유전자의 식별을 용이하게 할 수 있음을 보여줍니다. 임피던스 기반 실시간 세포 분석 시스템은 유전자 발현 변화에 따른 종양 세포 이동을 정량적이고 연속적이며 포괄적으로 모니터링할 수 있습니다. 종양을 과도하게 발현하고 종양 세포 이동을 자극하는 유전자는 암 치료에서 전이를 억제하는 잠재적 표적이 될 수 있습니다.
먼저, 10x 반응 완충액 10마이크로리터, PNE 원 1.5마이크로리터, 플라스미드 DNA 10마이크로그램을 마이크로 원심분리 튜브에 첨가하여 플라스미드 DNA를 제한효소로 선형화합니다. 뉴클레아제 유리수를 첨가하여 반응 부피를 100마이크로리터로 만듭니다. 섭씨 37도에서 밤새 반응 혼합물을 배양하기 전에 두드려서 회전시켜 혼합합니다.
다시, 스핀 다운하고 10 % SDS의 5 마이크로 리터와 RNA 등급 proteinase K의 밀리 리터 당 20 밀리그램의 1 마이크로 리터를 반응 혼합물에 첨가하여 혼합하고 스핀 다운합니다. 섭씨 50도에서 30분 동안 배양한 후 10x 전사 완충액, ATP, GTP, UTP, CTP 및 T7 각각 2마이크로리터와 선형화된 DNA 1마이크로그램을 T7 RNA 중합효소 매개 RNA 합성을 위한 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 뉴클레아제 유리수를 첨가하여 반응 부피를 20마이크로리터로 만듭니다.
스핀 다운 후 RNA 합성을 위해 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 스핀다운하여 1마이크로리터의 DNA를 추가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하기 전에 탭하여 템플릿 DNA를 제거합니다. 반응 혼합물에 10마이크로리터의 7.5몰 염화 리튬을 첨가하여 RNA의 염화 리튬 침전을 시작합니다.
탭하고 회전시킨 후 반응 혼합물을 섭씨 영하 20도에서 30분 동안 배양합니다. 캡핑을 위해 RNA 샘플을 섭씨 65도에서 10분 동안 가열한 다음 얼음 위에 올려 냉각합니다. 다음으로, 캡핑 반응 성분을 추가하고 탭하여 혼합합니다.
반응 혼합물을 회전시키고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. poly-A tailing의 경우 샘플을 스핀 다운하고 poly-A tailing 반응 성분을 추가합니다. 그런 다음 탭하고 회전시킨 다음 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.
염화 리튬 침전 및 합성 mRNA의 정량화를 위해 50 마이크로 리터의 7.5 몰 염화 리튬을 첨가하고 염화 리튬 침전을 수행한다. 냉동실에서 ECM 겔 스톡의 부분 표본을 꺼내 얼음 위에 보관하십시오. 마이크로 원심분리기 튜브에 990마이크로리터의 DMEM과 10마이크로리터의 ECM 겔을 혼합하여 리터당 10밀리그램의 ECM 겔을 작동 농도로 희석합니다.
부드러운 피펫팅으로 혼합합니다. 희석된 ECM 겔 60마이크로리터를 CIM 플레이트 상부 챔버의 16개 웰 각각에 추가합니다. 플레이트 커버가 벗겨진 CIM 플레이트의 상부 챔버를 이산화탄소 인큐베이터 내부의 보호 플라스틱 시트에 약 4시간 동안 놓아 겔 층을 형성합니다.
전기천공법의 경우 각 튜브의 종양 세포 현탁액에 1mL의 DPBS를 추가합니다. 셀 서스펜션을 탭하고 10초 동안 세 번 회전합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.
110 마이크로리터의 재현탁 완충액 R을 세포 펠릿에 첨가하여 10 마이크로리터에 0.1백만 개의 세포를 얻습니다. 세포 펠릿에 합성 mRNA를 첨가하여 원하는 발현 수준에 따라 마이크로리터 농도당 0.2 내지 20 나노그램을 얻는다. 세포 펠릿을 가볍게 혼합하고 두드려 재현탁시킵니다.
다음으로, 3 개의 펄스로 10 밀리 초 동안 10 밀리 초 동안 electroporation 시스템으로 셀 현탁액의 10 마이크로 리터를 전기 천공법으로 매번 전기 포레이션합니다. 완료되면 전기 천공된 셀을 0.5%FBS를 포함하는 1.1밀리리터의 DMEM이 있는 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 실시간 세포 분석 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 분석 프로그램을 엽니다.
기본 실험 패턴 설정 옵션을 연 후 세 가지 실험을 개별적으로 실행하는 옵션을 선택합니다. 번호 탭을 클릭하여 각 크래들을 엽니다. 그런 다음 실험 노트 탭을 클릭합니다.
폴더를 선택하고 실험 이름을 입력하여 데이터를 저장합니다. 레이아웃 탭을 클릭하고 한 번에 4개의 웰을 선택하여 각 처리 조건에 대해 쿼드 중복 웰을 설정합니다. 샘플 정보를 입력하고 적용을 클릭합니다.
일정 탭을 클릭한 다음 단계를 추가하여 셀 임피던스 측정의 2단계 모드를 설정합니다. 그런 다음 적용을 클릭하여 첫 번째 단계를 설정합니다. 단계 추가를 다시 클릭하고 간격에 10분, 이동 및 침입 기간에 48시간을 입력합니다.
그런 다음 적용을 클릭하여 두 번째 단계를 설정합니다. 세포 임피던스 측정 1시간 전에 10% 혈청 또는 기타 화학 유인 물질이 포함된 160마이크로리터의 DMEM을 CIM 플레이트의 하부 챔버 웰에 추가합니다. 침습을 위한 ECM 겔 코팅 웰 또는 하부 챔버와의 이동을 위한 코팅되지 않은 웰이 포함된 상부 챔버를 조립합니다.
세포 이동 분석을 위해 50마이크로리터의 저혈청 배지를 CIM 플레이트의 상부 챔버 웰에 추가합니다. CIM 플레이트와 시스템의 크래들을 CO2 인큐베이터에 놓습니다. 메시지 탭을 클릭합니다.
연결이 정상이면 CIM 플레이트를 실험할 준비가 되었다는 메시지가 표시됩니다. CIM 플레이트를 배양 조건에 적응시키기 위해 실시간 세포 분석 전에 조립된 CIM 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 30-60분 동안 사전 배양합니다. 기준선 판독값을 보려면 각 크래들의 시작 버튼을 클릭합니다.
다른 이름으로 저장 창이 나타나면 실험 파일을 저장하여 기준 읽기를 수행합니다. 셀 안착의 경우 크래들에서 CIM 플레이트를 제거하고 플레이트 홀더의 생물 안전 캐비닛에 놓습니다. 그런 다음 100, 000 세포를 포함하는 전기 천공 셀의 100 마이크로 리터를 CIM 플레이트의 상부 챔버의 우물에 추가하고 CIM 플레이트를 실온에서 30 분 동안 생물 안전 캐비닛에 남겨 둡니다.
완전히 조립된 CIM 플레이트를 해당 크래들로 다시 이동하여 셀 임피던스를 측정합니다. 크래들 시작 버튼과 플롯 탭을 클릭하여 두 번째 단계의 셀 임피던스 측정을 시작합니다. 그런 다음 모두 추가 버튼을 클릭하고 평균 및 표준 편차 상자를 선택하여 데이터를 실시간으로 시각화합니다.
다양한 농도의 합성 크랙 1 mRNA를 사용한 U 118 mg 교모세포종 세포의 전기천공법은 형질주입 1일 후 플래그 태그 크랙 1 단백질의 농도 의존적 증가를 초래했습니다. 마이크로리터 mRNA 당 0.2 및 2 나노그램은 외인성 균열 1 단백질의 검출 불가능하거나 겸손한 발현을 유도했습니다. 마이크로리터 mRNA 당 20 나노그램은 내인성 균열 1 단백질보다 발현 수준이 높았습니다.
세포 이동 분석은 electroporation이 마이크로리터 균열 당 0.2 또는 2 나노그램이었다는 것을 나타냈고, 1개의 mRNA는 세포 이동에 크게 영향을 미치지 않았다. 그러나, 마이크로리터 균열 당 20 nanograms 1 mRNA를 가진 electroporation는 교모세포종 세포 이동이 균열 하나 단백질 수준에 있는 증가에 의해 자극되었다는 것을 계시하는 2 그리고 13 시간 사이 이동하는 세포를 더를 가진 세포 이동의 명확한 자극으로 이끌어 냈습니다. 합성 크랙 L mRNA를 사용한 전기천공법은 형질주입 1일 후 플래그 태그가 붙은 크랙 L 단백질의 강력한 발현을 유도했습니다.
대조 세포의 침입은 ECM 단백질 농도가 증가함에 따라 느려졌습니다. 발현 세포에 대한 균열 L은 세포 침습에서 ECM 겔 농도 의존적 감소를 보여주었습니다. 서로 다른 ECM 겔 농도에서 발현하는 세포에 대한 대조군과 크랙 L의 비교는 크랙 L 과발현이 일반적으로 ECM 겔 층을 통한 세포 침입을 자극한다는 것을 나타냈습니다.
결과는 또한 두 세포 집단이 서로 다른 시점에서 ECM 겔 농도를 증가시킴으로써 차별적으로 영향을 받는다는 것을 시사했습니다. 재부유된 기포 R에서 세포를 오래 배양하면 세포가 건강하지 않기 때문에 세포는 재부유된 기포 R 사람들 전기천공법에서 빠르고 부드럽게, 완전하게 재현탁되어야 합니다. 빠르게 이동하는 종양 세포와 느리게 이동하는 종양 세포를 분리하여 두 세포 집단 간의 차이를 특성화할 수 있습니다.
