DD-PCR هي طريقة حساسة ودقيقة للغاية للقياس الكمي المطلق للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المستهدف. تم استخدامه لتشخيص المرض حيث تفشل الطرق التقليدية الأخرى في إعطاء نتائج دقيقة. DD-PCR هي التقنية الأكثر حساسية للكشف عن جزيئات الحمض النووي منخفضة جدا وفيرة.
على عكس تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، لا يتطلب DD-PCR أي تحكم جيني في التدبير المنزلي للقياس الكمي. نظرا لحساسيته ودقته ، يمكن استخدام dd-PCR كأداة للتشخيص الجزيئي والأبحاث التي تتضمن جزيئات RNA منخفضة الوفرة مثل الحمض النووي الريبي الصغير والحمض النووي الريبي الدائري. قبل استخدام dd-PCR ، يجب على المرء إجراء RT-PCR أو RT-qPCR للتأكد من أن البادئات تعمل على تضخيم جيناتها المستهدفة دون أي تضخيم PCR غير محدد.
للبدء ، قم بإعداد تسلسل قالب PCR بطول 200 نيوكليوتيد من خلال ضم آخر 100 نيوكليوتيد من إجمالي طول تسلسل الحمض النووي الريبي الدائري إلى أول 100 نيوكليوتيد من تسلسل الحمض النووي الريبي الدائري. استخدم تسلسل القالب للكتاب التمهيدي ، المصمم بواسطة أداة الويب Primer 3. خذ طبقا واحدا يبلغ طوله 10 سنتيمترات يحتوي على حوالي 5 ملايين خلية عضلية C2C12 متكاثرة وأنبوب عضلي C2C12 متمايز لمدة أربعة أيام لعزل الحمض النووي الريبي.
اغسل الخلايا ب 10 ملليلتر من 1X PBS ثلاث مرات وتخلص من PBS باستخدام ماصة. أضف ملليلتر واحد من كاشف عزل الحمض النووي الريبي وقم بتحليل الخلايا عن طريق ماصة قوية. ثم أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة لمدة 15 ثانية.
جهاز طرد مركزي للأنبوب عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 12،000 G.خذ 400 ميكرولتر من الطبقة المائية العليا ، وقم بتحميله على عمود السيليكا ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 12،000 G في درجة حرارة الغرفة. خذ التدفق إلى أنبوب جديد وأضف 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. أضف 20 ميكرولتر من حبات السيليكا المغناطيسية وضع الأنبوب على خلاط حراري ، مضبوط على 25 درجة مئوية و 1،200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.
ثم ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة 30 ثانية أو حتى يصبح المحلول واضحا. أعد تعليق حبات السيليكا المغناطيسية في 500 ميكرولتر من محلول الغسيل الذي يحتوي على 90٪ إيثانول. بعد وضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لمدة 30 ثانية ، اترك الحبيبات تستقر باتجاه المغناطيس وتخلص من المخزن المؤقت باستخدام ماصة.
جفف الأنبوب بالهواء عند 50 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق على خلاط حراري ، مع إبقاء الغطاء مفتوحا. أضف 20 ميكرولترا من الماء الخالي من النيوكلياز وأعد تعليق الخرز. اجمع الحمض النووي الريبي المذاب في أنبوب جديد لتقييم الكمية والجودة باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي وخذ ميكروجراما واحدا من الحمض النووي الريبي لتخليق cDNA. امزج ميكروجراما واحدا من إجمالي الحمض النووي الريبي مع ميكرولتر واحد من مزيج dNTP ، وأربعة ميكرولتر من محلول النسخ العكسي 5X ، وميكرولتر من التمهيدي العشوائي للنسخ العكسي 10X ، و 0.25 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي ، و 0.5 ميكرولتر من مثبط RNase. تشكل حجم إلى 20 ميكرولتر باستخدام المياه الحرة النيوكلياز.
ضع الأنبوب عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، تليها 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم ضع الأنبوب عند 85 درجة سلزية لمدة خمس دقائق لتعطيل الإنزيم. قم بإعداد تفاعل PCR البالغ 22 ميكرولترا في أنابيب أو شرائط PCR سعة 0.2 ملليلتر ، جنبا إلى جنب مع أنبوب التحكم السلبي وأنابيب التحكم غير القالب.
أضف 11 ميكرولترا من المزيج الرئيسي dd-PCR ، و 5.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي الأمامي والخلفي الدائري الخاص بالحمض النووي الريبي بتركيز ميكرومولار واحد ، و 5.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز لإعداد أنابيب تفاعل NTC. وبالمثل ، لإعداد أنابيب تفاعل الاختبار ، أضف 11 ميكرولترا من المزيج الرئيسي dd-PCR ، و 5.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي الأمامي والخلفي الدائري الخاص بالحمض النووي الريبي بتركيز ميكرومولار واحد ، و 5.5 ميكرولتر من cDNA. لتوليد القطيرات ، انقل 20 ميكرولترا من خليط PCR من أنابيب PCR 0.2 ملليلتر إلى آبار العينة لخرطوشة مولد القطيرات.
أضف 70 ميكرولتر من زيت توليد القطيرات إلى آبار النفط في خرطوشة مولد القطيرات بعناية ، باستخدام ماصة. قم بتغطية خرطوشة مولد القطيرات بحشية مطاطية وضعها في آلة مولد القطيرات للحصول على عينة مزيج قطرات الزيت ، المتولدة في آبار القطيرات للخرطوشة. لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، انقل 40 ميكرولترا من عينة مزيج قطرات الزيت من آبار القطيرات لخرطوشة مولد القطيرات إلى لوحة PCR ذات 96 بئرا باستخدام ماصة.
أغلق لوحة PCR التي تحتوي على 96 بئرا باستخدام مانع تسرب رقائق الألومنيوم. ضعه في كتلة آلة ختم الألواح ، مسخنا مسبقا عند 180 درجة مئوية ، وانقر فوق الختم لإغلاق لوحة PCR. بعد ذلك ، ضع اللوحة في دورة DD-PCR الحرارية واضبط درجة حرارة الغطاء على 105 درجة مئوية ومعدل المنحدر على درجتين مئويتين في الثانية.
بمجرد انتهاء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ضع اللوحة على آلة عداد قطرات dd-PCR مع حامل اللوحة في الموضع الصحيح لحساب القطرات. افتح برنامج تحليل القطرات وقم بإعداد التشغيل من خلال إدخال معلومات العينة. انقر فوق الزر "تحليل" لتحليل البيانات بعد الانتهاء من قراءة القطرات.
ثم ، انقر فوق الزر 1D Amplitude لرؤية القطرات الإيجابية والسالبة. لفصل القطرات الإيجابية عن القطرات السالبة ، ضع خط عتبة مشترك لجميع العينات التي لها نفس الهدف. انقر فوق زر التصدير لتصدير بيانات حساب الحمض النووي الريبي الدائري كملف csv.
تظهر البيانات المصدرة عدد الحمض النووي الريبي الدائري الموجود في كل عينة. احسب يدويا عدد الحمض النووي الريبوزي الدائري في كل عينة لكل نانوجرام من الحمض النووي الريبوزي (RNA) من خلال النظر في إجمالي كمية الحمض النووي المكمل (cDNA) المستخدمة في كل تفاعل. يظهر تحليل البيانات باستخدام برنامج QuantaSoft هنا.
أظهرت جميع العينات باستثناء MT1 أكثر من 12،000 قطرات. نظرا لأن إجمالي عدد القطيرات كان منخفضا في MT1 ، لم يتم النظر في هذه العينة لتحليل البيانات النهائي. ومن المثير للاهتمام ، كان هناك اختلاف واضح في نمط التعبير عن Circ B و C2 في حالة الأنبوب العضلي المتمايز لمدة أربعة أيام مقارنة بخلايا الأرومة العضلية.
أشار تحليل وفرة Circ B و C2 من حيث عدد النسخ ، إلى أن النسخ المتماثلة الثلاثة للخلايا العضلية C2C12 تحتوي على 76.8 و 67 و 46 نسخة لكل نانوجرام من الحمض النووي الريبي ، بينما تحتوي عينتا الأنبوب العضلي على 558 و 610 نسخة لكل نانوجرام من الحمض النووي الريبي. تمثل البيانات الموجودة في التمثيل البياني بالأعمدة المتوسط زائد ناقص الانحراف المعياري لاثنين إلى ثلاثة مكررات بيولوجية. ddPCR هي واحدة من أكثر الطرق تقدما لقياس التعبير التفاضلي الدقيق للحمض النووي الريبي الدائري المستهدف.
ستكون هذه الطريقة أداة أساسية لتسريع أبحاث الحمض النووي الريبي الدائري وصناعات التشخيص في العام المقبل.
