dd-PCR은 표적 DNA 또는 RNA의 절대 정량화를 위한 매우 민감하고 정확한 방법입니다. 다른 기존 방법으로는 정확한 결과를 제공하지 못하는 질병 진단에 사용되었습니다. dd-PCR은 매우 낮은 풍부 핵산 분자를 검출하기 위한 가장 민감한 기술입니다.
정량적 PCR과 달리 dd-PCR은 정량화를 위한 하우스키핑 유전자 제어가 필요하지 않습니다. 감도와 정확성으로 인해 dd-PCR은 마이크로 RNA 및 원형 RNA와 같은 낮은 풍부 RNA 분자와 관련된 분자 진단 및 연구를 위한 도구로 사용할 수 있습니다. dd-PCR을 사용하기 전에 RT-PCR 또는 RT-qPCR을 수행하여 프라이머가 비특이적 PCR 증폭 없이 표적 유전자를 증폭하고 있는지 확인해야 합니다.
시작하려면, 전체 원형 RNA 서열 길이의 마지막 100개 뉴클레오티드를 원형 RNA 서열의 처음 100개 뉴클레오티드에 결합함으로써 길이가 200개 뉴클레오티드 인 PCR 주형 서열을 준비한다. Primer 3 웹 도구로 디자인된 프라이머용 템플릿 시퀀스를 사용합니다. RNA 분리를 위해 약 500만 개의 증식하는 C2C12 근원세포 세포와 4일 분화된 C2C12 근관이 들어 있는 10cm 접시 하나를 가져갑니다.
세포를 10 밀리리터의 1X PBS로 3 회 세척하고 피펫을 사용하여 PBS를 버립니다. RNA 분리 시약 1밀리리터를 추가하고 격렬한 피펫팅으로 세포를 용해시킵니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 클로로포름을 넣고 15 초 동안 와동시킵니다.
튜브를 섭씨 4도에서 12, 000 G에서 10 분간 원심 분리하고 상부 수층 400 마이크로 리터를 취하여 실리카 컬럼에 넣고 실온에서 12, 000G에서 1 분간 원심 분리합니다. 새 튜브로 흐름을 가져 와서 600 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 첨가하십시오. 20 마이크로 리터의 자성 실리카 비드를 넣고 튜브를 섭씨 25도 및 1, 200RPM으로 5 분 동안 설정 한 열 혼합기에 놓습니다.
그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 30초 동안 또는 용액이 투명해질 때까지 놓습니다. 자성 실리카 비드를 90% 에탄올을 함유하는 500마이크로리터의 세척 완충액에 재현탁시킨다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 30초 동안 놓은 후 비드가 자석 쪽으로 가라앉도록 하고 피펫을 사용하여 버퍼를 버립니다.
튜브를 섭씨 50도에서 써모믹서에서 3분 동안 자연 건조하여 뚜껑을 열어 둡니다. 20마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 추가하고 비드를 재현탁합니다. 분광 광도계를 사용하여 양 및 품질 평가를 위해 용해 된 RNA를 새 튜브에 수집합니다.
분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정하고 cDNA 합성을 위해 1 마이크로 그램의 RNA를 취합니다. 1마이크로리터의 dNTP 믹스, 4마이크로리터의 5X 역전사효소 버퍼, 2마이크로리터의 10X 역전사효소 랜덤 프라이머, 0.25마이크로리터의 역전사효소 효소 및 0.5마이크로리터의 RNase 억제제와 1마이크로그램의 총 RNA를 혼합합니다. 뉴클레아제 자유수를 사용하여 부피를 20 마이크로리터로 구성한다.
튜브를 섭씨 25도에서 10 분 동안 놓은 다음 섭씨 50도에서 1 시간 동안 놓습니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 85도에 5 분 동안 두어 효소를 비활성화하십시오. 0.2 밀리리터 PCR 튜브 또는 스트립에 22 마이크로 리터의 PCR 반응을 음성 제어 튜브 및 비 템플릿 제어 튜브와 함께 설정합니다.
11마이크로리터의 dd-PCR 마스터 믹스, 5.5마이크로리터의 1마이크로몰 농도의 원형 RNA 특이적 정방향 및 역방향 프라이머 믹스, 5.5마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 추가하여 NTC 반응 튜브를 설정합니다. 유사하게, 테스트 반응 튜브를 설정하려면 11마이크로리터의 dd-PCR 마스터 믹스, 5.5마이크로리터의 1마이크로몰 농도의 원형 RNA 특이적 정방향 및 역방향 프라이머 믹스 및 5.5마이크로리터의 cDNA를 추가합니다. 액적 생성을 위해 20마이크로리터의 PCR 혼합물을 0.2밀리리터 PCR 튜브에서 액적 발생기 카트리지의 샘플 웰로 옮깁니다.
피펫을 사용하여 70마이크로리터의 액적 생성 오일을 액적 발생기 카트리지의 유정에 조심스럽게 추가합니다. 액적 발생기 카트리지를 고무 가스켓으로 덮고 액적 발생기 기계에 넣어 카트리지의 액적 우물에서 생성된 샘플 오일 방울 혼합물을 얻습니다. PCR 증폭을 위해 피펫을 사용하여 액적 발생기 카트리지의 액적 웰에서 40마이크로리터의 샘플 오일 액적 혼합물을 96웰 PCR 플레이트로 옮깁니다.
알루미늄 호일 실러로 96웰 PCR 플레이트를 밀봉합니다. 섭씨 180도로 예열된 플레이트 실러 기계 블록에 넣고 PCR 플레이트를 밀봉하기 위한 씰을 클릭합니다. 그런 다음 플레이트를 dd-PCR 열 순환기에 놓고 뚜껑 온도를 섭씨 105도로 설정하고 램프 속도를 초당 섭씨 2도로 설정합니다.
PCR이 끝나면 플레이트 홀더가 액적을 계수하기 위한 올바른 위치에 있는 상태에서 플레이트를 dd-PCR 액적 카운터 기계에 놓습니다. 액적 분석 소프트웨어를 열고 샘플 정보를 입력하여 실행을 설정합니다. 분석 버튼을 클릭하여 액적 판독 완료 후 데이터를 분석합니다.
그런 다음 1D 진폭 버튼을 클릭하여 양수 및 음수 방울을 확인합니다. 음의 물방울에서 양성 방울을 분리하려면 동일한 표적을 가진 모든 샘플에 대해 공통 임계 선을 설정하십시오. 내보내기 버튼을 클릭하여 원형 RNA 카운트 데이터를 csv 파일로 내보냅니다.
내보낸 데이터는 각 샘플에 존재하는 원형 RNA의 수를 보여줍니다. 각 반응에 사용된 cDNA의 총량을 고려하여 RNA 나노그램당 각 샘플의 원형 RNA 수를 수동으로 계산합니다. QuantaSoft 소프트웨어를 사용한 데이터 분석은 여기에 나와 있습니다.
MT1을 제외한 모든 샘플은 12, 000개 이상의 액적 카운트를 나타내었다. MT1에서 총 액적 수가 낮았기 때문에 이 샘플은 최종 데이터 분석에 고려되지 않았습니다. 흥미롭게도, 근원세포 세포와 비교하여 4일간 분화된 근관 조건에서 Circ B 및 C2의 발현 패턴에 뚜렷한 차이가 있었다.
복제 수 측면에서 Circ B 및 C2 풍부도를 분석한 결과, C2C12 근원세포의 3회 복제는 RNA 나노그램당 76.8, 67 및 46 카피를 갖는 반면, 2개의 근관 샘플은 RNA 나노그램당 558 및 610개의 카피를 가졌다. 막대 그래프의 데이터는 2-3개의 생물학적 반복실험의 평균과 표준 편차를 뺀 값을 나타냅니다. ddPCR은 표적 원형 RNA의 정확한 차등 발현을 측정하는 가장 진보된 방법 중 하나입니다.
이 방법은 내년에 순환 RNA 연구 및 진단 산업을 가속화하는 데 필수적인 도구가 될 것입니다.
