Bien que l’alimentation par membrane artificielle ait déjà été pratiquée, notre protocole est plus simple à mettre en place et adaptable à d’autres espèces de tiques avec quelques modifications. Le principal avantage de l’alimentation par membrane artificielle est qu’elle permet une exposition à des agents pathogènes et à des traitements qui peuvent ne pas être réalisables par l’alimentation animale. Ce système d’alimentation par membrane artificielle peut être appliqué à d’autres espèces d’arthropodes avec quelques tests pour les phagostimulants idéaux et des modifications sur l’épaisseur idéale de la membrane.
Produire la bonne épaisseur de membrane nécessite une certaine pratique. Assurez-vous d’utiliser un micromètre pour mesurer l’épaisseur à plusieurs endroits sur la membrane. Benjamin Cull, postdoc dans notre laboratoire m’aidera à démontrer la procédure.
Pour commencer, essuyez une surface plane et non poreuse telle qu’une vitre ou une base métallique revêtue de céramique d’un support de bras avec de l’éthanol à 70%, puis recouvrez-la d’une seule couche de pellicule de plastique. Assurez-vous que la pellicule de plastique est plate et sans bulles ni rides. Collez du papier nettoyant 100% rayonne sur la surface préparée.
Assurez-vous qu’il est plat et légèrement tendu avec du ruban adhésif sur les quatre côtés du papier. Préparez le mélange de silicone de dureté 0010 en mesurant cinq millilitres de chaque partie du kit de silicone dans un récipient jetable. Mélangez légèrement les deux liquides et ajoutez 1,5 millilitre d’hexane.
Continuer à mélanger jusqu’à ce que le mélange soit homogène et bien mélangé. Utilisez une petite raclette pour répartir le mélange de silicone sur le papier pour lentilles et laissez-le reposer pendant une minute pour vous assurer que le silicone a trempé dans le papier pour lentilles. Régulièrement, grattez l’excès de silicone sur le côté avec la raclette en utilisant une petite quantité de pression vers le bas.
Effectuez un deuxième passage avec la raclette sans exercer la pression vers le bas pour enlever les lignes de silicone et produire une couche lisse. Pour les larves seulement, trempez le haut de la chambre d’alimentation dans la résine fluoropolymère Fluon plusieurs fois, ce qui lui permet de sécher entre les applications pour produire une couche cohérente. Laissez durcir la membrane pendant au moins 24 heures dans un environnement exempt de poussière, comme une enceinte chimique ou de biosécurité fermée.
Ensuite, mélangez des parties égales de mélange de silicone A et B pour préparer le mélange de silicone de 30 dureté pour fixer les chambres à la membrane. Trempez les chambres en polycarbonate d’environ un quart de pouce dans le mélange de silicone, puis placez-les sur la feuille de membrane, en prenant soin de ne pas chevaucher les bandes. Laissez durcir le silicone de fixation pendant au moins 24 heures.
À l’aide d’un scalpel, coupez soigneusement la membrane autour de chacune des chambres attachées, en coupant les bords afin qu’elle puisse s’insérer en douceur dans un puits des six plaques de puits sans trop gratter sur les côtés. Laisser suffisamment de matériau à l’extérieur de la chambre pour maximiser l’ajout de la membrane. Coupez un petit morceau de la membrane restante de chaque coin et du centre de la feuille de membrane.
Retirez la pellicule de plastique de chaque pièce et mesurez les pièces avec un micromètre pour déterminer l’épaisseur moyenne de la membrane. Placez les chambres d’alimentation avec un joint torique par chambre dans un bécher en verre à autoclaver à 121 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes pour stériliser. Laissez les chambres refroidir avant de les utiliser.
Après avoir retiré les chambres à membrane autoclavées pré-préparées et placé le joint torique autour d’elles, remplissez chaque chambre avec suffisamment d’éthanol à 70% pour couvrir la membrane. Laissez-le reposer dans une plaque de six puits pendant cinq minutes, puis recherchez toute fuite entre la chambre et la membrane et dans la membrane elle-même. Videz l’éthanol des chambres, puis laissez-le sécher à l’air libre à l’intérieur d’une armoire de biosécurité ou d’une hotte à flux laminaire.
Pour chauffer et activer le complément dans le sang, chauffez-le à 56 degrés Celsius pendant 40 minutes et complétez le sang bovin défibrillé mécaniquement avec deux grammes par litre de glucose. Une fois la membrane sèche, appliquez environ 20 microlitres de phagostimulant à l’intérieur de la chambre et inclinez la chambre pour l’étaler sur la surface. Lorsque le phagostimulant est sec, ajoutez rapidement les tiques dans la chambre avec une brosse ou une pince.
Scellez le dessus avec du parafilm car la chaleur du bain-marie peut le déchirer. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de chaleur et de sang activé par puits ou chambre dans un tube conique et placez-le dans le bain-marie réglé à 36 degrés Celsius. Ajouter cinq microlitres de trois millimolaires d’ATP et 50 microlitres de 100X stock de pénicilline streptomycine fonzone par cinq millilitres de sang dans le tube et transférer 4,5 millilitres de sang dans un puits d’une plaque à six puits.
Placez doucement la chambre dans le puits, en ajustant la hauteur du joint torique sur la chambre de sorte que la membrane reste dans le sang, mais que le taux sanguin autour du côté ne dépasse pas le puits. Ensuite, placez le puits dans le sang à un angle pour éviter la formation de bulles d’air entre le sang et la membrane. Placez le couvercle de la plaque des six puits au-dessus des chambres d’alimentation.
Placez la plaque à six puits avec les chambres dans le bain-marie préparé à 34 degrés Celsius et le couvercle. Ajouter cinq microlitres de trois millimolaires d’ATP et 50 microlitres de 100X stock de pénicilline streptomycine fonzone par puits dans le tube de sang et transférer 4,5 millilitres de sang dans un puits d’une nouvelle plaque de six puits comme indiqué précédemment. Retirez la plaque à six puits avec la chambre à tiques du bain-marie et retirez la chambre du puits.
Rincez l’extérieur de la chambre et de la membrane avec 10 millilitres de PBS 1X stérilisé pour éliminer le sang. À l’aide de papier filtre autoclavé, sécher doucement la membrane et la chambre pour éliminer l’excès de PBS. S’il y a beaucoup de condensation à l’intérieur de la chambre, séchez les taches humides avec du papier filtre autoclavé avant de le sceller avec un nouveau parafilm.
Replacez ensuite le parafilm sur le dessus de la chambre. Placez la chambre à tiques dans la nouvelle plaque à six puits avec du sang frais, en ajustant la hauteur du joint torique si nécessaire. Répétez ces étapes pour chaque chambre de la plaque.
Enfin, placez le couvercle de la plaque à six puits au-dessus des chambres et replacez la nouvelle plaque à six puits dans le bain-marie de 34 degrés Celsius. Un aliment continu avec des nymphes ixodes scapularis partiellement engorgées est montré ici. Les points noirs ou bruns autour des sites de fixation sont le gel qui peut être recueilli pendant et après l’alimentation pour fabriquer le phagostimulant.
Des nymphes ixodes scapularis partiellement engorgées sont visibles attachées à la membrane. Une enveloppe de la moisissure des larves engorgées peut également être vue ici. Les nombres d’engorgement des tiques et les poids massiques des œufs sont présentés dans ce tableau.
Les conditions expérimentales d’engorgement larvaire et nymphal avaient un homogénat d’organe de cerf ajouté au sang en plus des suppléments utilisés dans cette technique. Ici, l’engorgement réussi a été défini comme des tiques engorgées qui ont mué avec succès au stade vivant suivant ou des femelles engorgées qui ont réussi à pondre des œufs. Il faut de la pratique pour obtenir une épaisseur acceptable lors de l’application de silicone sur le papier pour lentilles, il est donc toujours important de mesurer l’épaisseur de la membrane avant utilisation.
L’alimentation par membrane peut exposer les tiques à des agents pathogènes ou à des antibiotiques. Les effets de ceux-ci sur des aspects de la biologie des tiques tels que le succès de la mue, la ponte et la survie peuvent être évalués après l’alimentation.
