Während die künstliche Membranfütterung bereits früher durchgeführt wurde, ist unser Protokoll einfacher einzurichten und mit einigen Modifikationen an andere Zeckenarten anpassbar. Der Hauptvorteil der künstlichen Membranfütterung besteht darin, dass sie eine Exposition gegenüber Krankheitserregern und Behandlungen ermöglicht, die möglicherweise nicht durch Tierfütterung durchführbar sind. Dieses künstliche Membranfütterungssystem kann auf andere Arthropodenarten angewendet werden, wobei einige Tests auf ideale Phagostimulanzien und Modifikationen der idealen Membrandicke durchgeführt werden.
Die Herstellung der richtigen Membrandicke erfordert etwas Übung. Achten Sie darauf, ein Mikrometer zu verwenden, um die Dicke an mehreren Stellen auf der Membran zu messen. Benjamin Cull, Postdoc in unserem Labor, wird mir helfen, das Verfahren zu demonstrieren.
Wischen Sie zunächst eine flache, nicht poröse Oberfläche wie eine Glasscheibe oder eine keramikbeschichtete Metallbasis eines Armständers mit 70% Ethanol ab und bedecken Sie sie dann mit einer einzigen Schicht Plastikfolie. Stellen Sie sicher, dass die Plastikfolie flach und ohne Blasen oder Falten ist. Kleben Sie 100%iges Rayon-Linsenreinigungspapier auf die vorbereitete Oberfläche.
Stellen Sie sicher, dass es flach und leicht gespannt ist, mit Klebeband auf allen vier Seiten des Papiers. Bereiten Sie die 0010-Silikonmischung vor, indem Sie fünf Milliliter jedes Teils des Silikonkits in einen Einwegbehälter abmessen. Mischen Sie die beiden Flüssigkeiten leicht und fügen Sie 1,5 Milliliter Hexan hinzu.
Mischen Sie weiter, bis die Mischung homogen und gründlich gemischt ist. Verteilen Sie die Silikonmischung mit einem kleinen Rakel auf dem Linsenpapier und lassen Sie sie eine Minute stehen, um sicherzustellen, dass das Silikon in das Linsenpapier eingedrungen ist. Kratzen Sie das überschüssige Silikon mit dem Rakel mit etwas Druck nach unten zur Seite.
Führen Sie einen zweiten Durchgang mit dem Rakel durch, ohne den Druck nach unten auszuüben, um Silikonlinien zu entfernen und eine glatte Schicht zu erzeugen. Tauchen Sie nur für Larven die Oberseite der Fütterungskammer mehrmals in Fluon-Fluorpolymerharz, damit sie zwischen den Anwendungen trocknen kann, um eine gleichmäßige Schicht zu erzeugen. Lassen Sie die Membran mindestens 24 Stunden in einer staubfreien Umgebung aushärten, z. B. in einer geschlossenen Chemikalien- oder Biosicherheitswerkbank.
Als nächstes mischen Sie gleiche Teile der Silikonmischung A und B, um die Silikonmischung mit 30 Härten vorzubereiten, um die Kammern an der Membran zu befestigen. Tauchen Sie die Polycarbonatkammern etwa einen Viertelzoll in die Silikonmischung ein und legen Sie sie dann auf die Membranfolie, wobei Sie darauf achten, dass sich keines der Bänder überlappt. Lassen Sie das anhaftende Silikon mindestens 24 Stunden aushärten.
Schneiden Sie die Membran vorsichtig mit einem Skalpell um jede der angebrachten Kammern herum und schneiden Sie die Kanten so ab, dass sie problemlos in eine Vertiefung der Sechs-Well-Platte passt, ohne dass die Seiten stark abgekratzt werden. Lassen Sie genügend Material außerhalb der Kammer, um die Zugabe der Membran zu maximieren. Schneiden Sie ein kleines Stück der übrig gebliebenen Membran aus jeder Ecke und der Mitte der Membranfolie.
Entfernen Sie die Plastikfolie von jedem Stück und messen Sie die Stücke mit einem Mikrometer, um die durchschnittliche Membrandicke zu bestimmen. Legen Sie die Fütterungskammern zusammen mit einem O-Ring pro Kammer in ein Glasbecherglas und werden mindestens 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius sterilisiert. Lassen Sie die Kammern abkühlen, bevor Sie sie verwenden.
Nachdem Sie die vorbereiteten, autoklavierten Membrankammern herausgenommen und den O-Ring um sie herum platziert haben, füllen Sie jede Kammer mit genügend 70% Ethanol, um die Membran zu bedecken. Lassen Sie es fünf Minuten lang in einer Platte mit sechs Vertiefungen stehen und suchen Sie dann nach Leckagen zwischen der Kammer und der Membran sowie in der Membran selbst. Entleeren Sie das Ethanol aus den Kammern und lassen Sie es dann in einer Biosicherheitswerkbank oder einer Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen.
Um das Komplement im Blut zu erhitzen und zu aktivieren, erhitzen Sie es 40 Minuten lang bei 56 Grad Celsius und ergänzen Sie mechanisch defibrilliertes Rinderblut mit zwei Gramm pro Liter Glukose. Sobald die Membran trocken ist, tragen Sie etwa 20 Mikroliter Phagostimulans auf das Innere der Kammer auf und kippen Sie die Kammer, um sie auf der Oberfläche zu verteilen. Wenn das Phagostimulans trocken ist, fügen Sie die Zecken schnell mit einer Bürste oder einer Pinzette in die Kammer hinzu.
Versiegeln Sie die Oberseite mit Parafilm, da die Hitze des Wasserbades dazu führen kann, dass sie reißt. Dann fünf Milliliter der Hitze und des aktivierten Blutes pro Vertiefung oder Kammer in ein konisches Röhrchen geben und in das bei 36 Grad Celsius eingestellte Wasserbad geben. Fügen Sie fünf Mikroliter drei Millimolar ATP und 50 Mikroliter 100X Penicillin-Streptomycin-Fungizone pro fünf Milliliter Blut in das Röhrchen hinzu und übertragen Sie 4,5 Milliliter des Blutes in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.
Legen Sie die Kammer vorsichtig in die Vertiefung und stellen Sie die Höhe des O-Rings auf der Kammer so ein, dass die Membran im Blut sitzt, aber der Blutspiegel an der Seite die Vertiefung nicht übersteigt. Legen Sie dann den Brunnen in einem Winkel in das Blut, um eine Luftblasenbildung zwischen dem Blut und der Membran zu vermeiden. Setzen Sie den Deckel der sechs Well-Platten auf die Fütterungskammern.
Legen Sie die Sechs-Well-Platte mit den Kammern in das vorbereitete 34 Grad Celsius warme Wasserbad und den Deckel. Fügen Sie fünf Mikroliter drei Millimolar ATP und 50 Mikroliter 100X Vorrat an Penicillin Streptomycin Fungizon pro Vertiefung in die Blutröhre hinzu und übertragen Sie 4,5 Milliliter Blut in eine Vertiefung einer frischen Sechs-Well-Platte, wie zuvor gezeigt. Nehmen Sie die Sechs-Well-Platte mit der Zeckenkammer aus dem Wasserbad und entfernen Sie die Kammer aus dem Brunnen.
Spülen Sie die Außenseite der Kammer und der Membran mit 10 Milliliter sterilisiertem 1X PBS, um das Blut zu entfernen. Tupfen Sie die Membran und die Kammer mit autoklaviertem Filterpapier vorsichtig trocken, um das überschüssige PBS zu entfernen. Wenn sich in der Kammer viel Kondenswasser befindet, tupfen Sie die nassen Stellen mit autoklaviertem Filterpapier ab, bevor Sie es mit frischem Parafilm versiegeln.
Setzen Sie dann den Parafilm auf der Oberseite der Kammer ein. Legen Sie die Zeckenkammer in die neue Sechs-Well-Platte mit frischem Blut und passen Sie bei Bedarf die Höhe des O-Rings an. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Kammer auf der Platte.
Zum Schluss legen Sie den Deckel der Sechs-Well-Platte über die Oberseite der Kammern und schieben Sie die neue Sechs-Well-Platte zurück in das 34 Grad Celsius warme Wasserbad. Eine laufende Fütterung mit teilweise verstopften Nymphen von ixodes scapularis ist hier zu sehen. Die schwarzen oder braunen Punkte um die Befestigungsstellen sind der Frost, der während und nach der Fütterung gesammelt werden kann, um das Phagostimulans herzustellen.
Teilweise verstopfte Ixodes scapularis-Nymphen sind an der Membran befestigt. Auch eine Schale des verstopften Larvenschimmelpilzes ist hier zu sehen. Die Zeckenschwellungszahlen und die Gewichte der Eiermasse sind in dieser Tabelle dargestellt.
Bei der Larven- und Nymphenverstopfung wurde zusätzlich zu den in dieser Technik verwendeten Ergänzungen dem Blut ein Hirschorganhomogenat zugesetzt. Hier wurde eine erfolgreiche Verstopfung entweder als geschwollene Zecken definiert, die sich erfolgreich zum nächsten lebenden Stadium häuteten, oder als verstopfte Weibchen, die erfolgreich Eier legten. Es braucht Übung, um eine akzeptable Dicke zu erhalten, wenn Silikon auf das Linsenpapier aufgetragen wird, daher ist es immer wichtig, die Dicke der Membran vor dem Gebrauch zu messen.
Die Membranfütterung kann Zecken Krankheitserregern oder Antibiotika aussetzen. Die Auswirkungen auf Aspekte der Zeckenbiologie wie Häutungserfolg, Eiablage und Überleben können nach der Fütterung beurteilt werden.
