Mentre l'alimentazione artificiale a membrana è stata fatta prima, il nostro protocollo è più semplice da impostare e adattabile ad altre specie di zecche con alcune modifiche. Il vantaggio principale dell'alimentazione artificiale a membrana è che consente l'esposizione a agenti patogeni e trattamenti che potrebbero non essere fattibili attraverso l'alimentazione animale. Questo sistema di alimentazione artificiale a membrana può essere applicato ad altre specie di artropodi con alcuni test per i fagostimolanti ideali e modifiche sullo spessore ideale della membrana.
Produrre lo spessore corretto della membrana richiede un po' di pratica. Assicurati di utilizzare un micrometro per misurare lo spessore in diversi punti della membrana. Benjamin Cull, un postdoc nel nostro laboratorio mi aiuterà a dimostrare la procedura.
Per iniziare, pulire una superficie piana e non porosa come una lastra di vetro o una base di metallo rivestita in ceramica di un supporto da braccio con etanolo al 70% e quindi coprirlo con un singolo strato di pellicola trasparente. Assicurati che l'involucro di plastica sia piatto e senza bolle o rughe. Fissare con nastro adesivo la carta per la pulizia delle lenti in rayon al 100% sulla superficie preparata.
Assicurarsi che sia piatto e leggermente teso con nastro adesivo su tutti e quattro i lati della carta. Preparare la miscela di silicone di durezza 0010 misurando cinque millilitri di ciascuna parte del kit di silicone in un contenitore monouso. Mescolare leggermente i due liquidi e aggiungere 1,5 millilitri di esano.
Continuare a mescolare fino a quando il composto è omogeneo e ben miscelato. Utilizzare un piccolo tergipavimento per distribuire la miscela di silicone sulla carta per lenti e lasciarla riposare per un minuto per assicurarsi che il silicone si sia impregnato nella carta per lenti. Costantemente, raschiare il silicone in eccesso sul lato con il tergipavimento usando una piccola quantità di pressione verso il basso.
Eseguire un secondo passaggio con il tergipavimento senza esercitare la pressione verso il basso per rimuovere eventuali linee di silicone e produrre uno strato liscio. Solo per le larve, immergere più volte la parte superiore della camera di alimentazione nella resina fluoropolimerica Fluon, lasciandola asciugare tra le applicazioni per produrre uno strato coerente. Lasciare la membrana a polimerizzare per almeno 24 ore in un ambiente privo di polvere come un armadio chimico o di biosicurezza chiuso.
Quindi, mescolare parti uguali di miscela siliconica A e B per preparare la miscela di silicone di durezza 30 per attaccare le camere alla membrana. Immergere le camere in policarbonato di circa un quarto di pollice nella miscela siliconica e quindi posizionarle sul foglio di membrana, facendo attenzione a non sovrapporre nessuno dei nastri. Lasciare indurire il silicone di fissaggio per almeno 24 ore.
Usando un bisturi, tagliare con cura la membrana attorno a ciascuna delle camere attaccate, tagliando i bordi in modo che possa adattarsi agevolmente in un pozzetto della piastra a sei pozzetti senza molto raschiare sui lati. Lasciare materiale sufficiente all'esterno della camera per massimizzare l'aggiunta della membrana. Tagliare un piccolo pezzo della membrana rimanente da ogni angolo e dal centro del foglio di membrana.
Rimuovere l'involucro di plastica da ogni pezzo e misurare i pezzi con un micrometro per determinare lo spessore medio della membrana. Posizionare le camere di alimentazione insieme a un O-ring per camera in un becher di vetro da autoclavare a 121 gradi Celsius per almeno 20 minuti per sterilizzare. Lasciare raffreddare le camere prima di utilizzarle.
Dopo aver estratto le camere a membrana autoclavate pre-preparate e aver posizionato l'O-ring attorno ad esse, riempire ogni camera con abbastanza etanolo al 70% per coprire la membrana. Lasciare riposare in una piastra a sei pozzetti per cinque minuti e poi cercare eventuali perdite tra la camera e la membrana e nella membrana stessa. Svuotare l'etanolo dalle camere e quindi lasciarlo asciugare all'aria all'interno di un armadio di biosicurezza o di una cappa a flusso laminare.
Per riscaldare e attivare il complemento nel sangue, riscaldarlo a 56 gradi Celsius per 40 minuti e integrare il sangue bovino defibrillato meccanicamente con due grammi per litro di glucosio. Una volta che la membrana è asciutta, applicare circa 20 microlitri di fagostimolante all'interno della camera e inclinare la camera per diffonderla sulla superficie. Quando il fagostimolante è asciutto, aggiungere rapidamente le zecche alla camera con un pennello o una pinza.
Sigillare la parte superiore con parafilm poiché il calore del bagno d'acqua può causarne lo strappo. Quindi aggiungere cinque millilitri di calore e sangue attivato per pozzetto o camera in un tubo conico e metterlo a bagnomaria impostato a 36 gradi Celsius. Aggiungere cinque microlitri di ATP a tre millimolari e 50 microlitri di stock 100X di fungizone streptomicina penicillina per cinque millilitri di sangue al tubo e trasferire 4,5 millilitri di sangue in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Posizionare delicatamente la camera nel pozzetto, regolando l'altezza dell'O-ring sulla camera in modo che la membrana si trovi nel sangue, ma il livello del sangue intorno al lato non sovrasta il pozzetto. Quindi posizionare il pozzo nel sangue ad angolo per evitare la formazione di bolle d'aria tra il sangue e la membrana. Posizionare il coperchio della piastra a sei pozzetti sopra le camere di alimentazione.
Metti la piastra a sei pozzetti con le camere nel bagno d'acqua preparato a 34 gradi Celsius e nel coperchio. Aggiungere cinque microlitri di ATP a tre millimolari e 50 microlitri di stock 100X di funghizone streptomicina penicillina per pozzetto al tubo sanguigno e trasferire 4,5 millilitri di sangue in un pozzetto di una piastra fresca a sei pozzetti come mostrato in precedenza. Estrarre la piastra a sei pozzetti con la camera di zecca dal bagno d'acqua e rimuovere la camera dal pozzo.
Risciacquare l'esterno della camera e della membrana con 10 millilitri di PBS 1X sterilizzato per rimuovere il sangue. Utilizzando carta da filtro autoclavata, tamponare delicatamente la membrana e la camera per rimuovere il PBS in eccesso. Se c'è molta condensa all'interno della camera, tamponare i punti umidi con carta da filtro autoclavata prima di sigillarla con un nuovo parafilm.
Quindi sostituire il parafilm sulla parte superiore della camera. Posizionare la camera tick nella nuova piastra a sei pozzetti con sangue fresco, regolando l'altezza dell'O-ring se necessario. Ripetere questi passaggi per ogni camera sulla piastra.
Infine, posizionare il coperchio della piastra a sei pozzetti sopra la parte superiore delle camere e spostare la nuova piastra a sei pozzetti nel bagno d'acqua a 34 gradi Celsius. Qui viene mostrato un feed in corso con ninfe ixodes scapularis parzialmente ingorgate. I punti neri o marroni attorno ai siti di attacco sono il gelo che può essere raccolto durante e dopo il pasto per rendere il fagostimolante.
Le ninfe ixodes scapularis parzialmente ingorgate sono viste attaccate alla membrana. Qui si può vedere anche una buccia della muffa delle larve ingorgate. I numeri di ingorgo delle zecche e i pesi della massa delle uova sono presentati in questa tabella.
Le condizioni sperimentali di ingorgo larvale e ninfale, hanno aggiunto omogenato di organi di cervo al sangue oltre agli integratori utilizzati in questa tecnica. Qui, l'ingorgo riuscito è stato definito come zecche ingorgate che si sono ammutate con successo allo stadio vivo successivo o femmine ingorgate che hanno deposto con successo le uova. Ci vuole pratica per ottenere uno spessore accettabile quando si applica il silicone alla carta delle lenti, quindi è sempre importante misurare lo spessore della membrana prima dell'uso.
L'alimentazione a membrana può esporre le zecche a patogeni o antibiotici. Gli effetti di questi su aspetti della biologia delle zecche come il successo della muta, la deposizione delle uova e la sopravvivenza possono essere valutati dopo l'alimentazione.
