人工膜給餌は以前にも行われていましたが、私たちのプロトコルはセットアップが簡単で、いくつかの変更を加えることで他のダニ種に適応できます。人工膜給餌の主な利点は、動物の給餌では実行できない可能性のある病原体や治療への曝露を可能にすることです。この人工膜供給システムは、理想的な食刺激剤のテストと理想的な膜の厚さの変更により、他の節足動物種に適用できます。
正しい膜の厚さを作り出すには、ある程度の練習が必要です。必ずマイクロメーターを使用して、メンブレン上のいくつかの場所で厚さを測定してください。私たちの研究室のポスドクであるベンジャミン・カルは、私が手順を実証するのを手伝ってくれます。
まず、アームスタンドのガラス板やセラミックコーティングされた金属ベースなどの平らで非多孔質の表面を70%エタノールで拭き取り、次に単層のラップで覆います。ラップが平らで、泡やしわがないことを確認してください。準備した面に100%レーヨンレンズクリーニングペーパーをテープで留めます。
用紙の4面すべてにテープで平らで少しぴんと張っていることを確認します。0010硬度のシリコーン混合物を、シリコーンキットの各部分の5ミリリットルを使い捨て容器に測定して調製します。2つの液体を軽く混合し、1.5ミリリットルのヘキサンを加えます。
混合物が均質になり、完全に混合されるまで混合を続けます。小さなスキージを使用してシリコンミックスをレンズペーパーに分散させ、1分間放置して、シリコンがレンズペーパーに染み込んでいることを確認します。着実に、少量の下向きの圧力を使用して、スキージで余分なシリコーンを側面にこすり落とします。
下向きの圧力をかけずにスキージで2回目のパスを実行し、シリコーンの線を取り除き、滑らかな層を生成します。幼虫の場合のみ、給餌チャンバーの上部をフルオンフルオロポリマー樹脂に数回浸し、アプリケーション間で乾燥させて一貫した層を生成します。メンブレンを、密閉された化学薬品やバイオセーフティキャビネットなどのほこりのない環境で少なくとも24時間硬化させます。
次に、シリコーンミックスAとBを等量混合して、チャンバーを膜に取り付けるための30硬度のシリコーン混合物を調製します。ポリカーボネートチャンバーをシリコーン混合物に約4分の1インチ浸してから、テープが重ならないように注意しながら、メンブレンシートの上に置きます。付着したシリコーンを少なくとも24時間硬化させます。
メスを使用して、取り付けられた各チャンバーの周りの膜を慎重に切断し、側面をあまりこすらずに6つのウェルプレートのウェルにスムーズに収まるようにエッジをトリミングします。膜の添加を最大化するのに十分な材料をチャンバーの外に許可します。メンブレンシートの各コーナーと中央から残ったメンブレンの小片を切り取ります。
各ピースからラップを取り外し、マイクロメーターでピースを測定して、平均膜の厚さを決定します。チャンバーごとに1つのOリングと一緒に給餌チャンバーをガラスビーカーに入れ、摂氏121度で少なくとも20分間オートクレーブ滅菌します。チャンバーを使用する前に、チャンバーを冷ましてください。
事前に準備されたオートクレーブ処理されたメンブレンチャンバーを取り出し、それらの周りにOリングを配置した後、各チャンバーにメンブレンを覆うのに十分な70%エタノールを充填します。6ウェルプレートに5分間置いてから、チャンバーとメンブレンの間、およびメンブレン自体に漏れがないか探します。チャンバーからエタノールを空にし、バイオセーフティキャビネットまたは層流フード内で風乾させます。
血液中の補体を加熱して活性化するには、摂氏56度で40分間加熱し、機械的に除細動した牛の血液にグルコース1リットルあたり2グラムを補給します。膜が乾いたら、チャンバーの内側に約20マイクロリットルの食刺激剤を塗布し、チャンバーを傾けて表面全体に広げます。食刺激剤が乾いたら、ブラシまたは鉗子でダニをチャンバーにすばやく追加します。
水浴からの熱がそれを裂く可能性があるので、パラフィルムで上部を密封してください。次に、ウェルまたはチャンバーごとに5ミリリットルの熱と活性化血液を円錐形のチューブに入れ、摂氏36度に設定した水浴に入れます。5ミリリットルの血液あたり5マイクロリットルの3ミリモルATPと50マイクロリットルの100Xストックのペニシリンストレプトマイシン菌類をチューブに加え、4.5ミリリットルの血液を6ウェルプレートのウェルに移します。
チャンバーをウェルにそっと置き、チャンバーのOリングの高さを調整して、膜が血液中に入るようにしますが、側面の周りの血液濃度はウェルの上にありません。次に、血液と膜の間に気泡が形成されないように、ウェルを斜めに血液に入れます。6つのウェルプレートの蓋を給餌チャンバーの上に置きます。
チャンバー付きの6つのウェルプレートを用意した摂氏34度の水浴と蓋に入れます。ウェルあたり5マイクロリットルの3ミリモルATPと50マイクロリットルの100Xストックのペニシリンストレプトマイシンファンギゾンを血液チューブに加え、前に示したように4.5ミリリットルの血液を新鮮な6ウェルプレートのウェルに移します。ティックチャンバー付きの6つのウェルプレートを水浴から取り出し、チャンバーをウェルから取り外します。
チャンバーと膜の外側を10ミリリットルの滅菌済み1X PBSですすぎ、血液を除去します。オートクレーブ処理したろ紙を使用して、メンブレンとチャンバーを軽くたたいて乾かし、余分なPBSを取り除きます。チャンバー内に結露が多い場合は、オートクレーブ滅菌したろ紙で濡れた部分を軽くたたいてから、新しいパラフィルムで密封してください。
次に、チャンバーの上部にあるパラフィルムを交換します。ティックチャンバーを新鮮な血液を入れた新しい6ウェルプレートに入れ、必要に応じてOリングの高さを調整します。プレート上のチャンバーごとにこれらの手順を繰り返します。
最後に、6ウェルプレートの蓋をチャンバーの上部に置き、新しい6ウェルプレートを摂氏34度の水浴に戻します。部分的に充血したixodes scapularisニンフを含む進行中の飼料がここに示されています。付着部位の周りの黒または茶色の点は、食刺激剤を作るために飼料中および飼料後に収集できる霜です。
部分的に充血した肩甲骨ニンフが膜に付着しているのが見られる。充血した幼虫カビの殻もここで見ることができます。ダニの充血数と卵の質量の重みをこの表に示します。
幼虫および幼虫の充血実験条件では、この技術で使用されるサプリメントに加えて、シカ器官ホモジネートが血液に添加されました。ここでは、成功した充血は、次の生きた段階に脱皮した充血したダニ、または産卵に成功した充血した雌のいずれかとして定義されました。レンズ紙にシリコーンを塗布するときは、許容可能な厚さを得るには練習が必要なため、使用前に膜の厚さを測定することが常に重要です。
膜摂食はダニを病原体や抗生物質にさらす可能性があります。脱皮の成功、産卵、生存などのダニ生物学の側面に対するこれらの影響は、飼料後に評価することができます。
