Si bien la alimentación por membrana artificial se ha realizado antes, nuestro protocolo es más simple de configurar y adaptable a otras especies de garrapatas con algunas modificaciones. La principal ventaja de la alimentación artificial por membrana es que permite la exposición a patógenos y tratamientos que pueden no ser factibles a través de la alimentación animal. Este sistema de alimentación por membrana artificial se puede aplicar a otras especies de artrópodos con algunas pruebas de fagostimulantes ideales y modificaciones en el grosor ideal de la membrana.
Producir el grosor de membrana correcto requiere algo de práctica. Asegúrese de usar un micrómetro para medir el grosor en varios lugares de la membrana. Benjamin Cull, un postdoctorado en nuestro laboratorio me ayudará a demostrar el procedimiento.
Para comenzar, limpie una superficie plana y no porosa, como un panel de vidrio o una base de metal recubierta de cerámica de un soporte de brazo con 70% de etanol y luego cúbrala con una sola capa de envoltura de plástico. Asegúrese de que la envoltura de plástico sea plana y sin burbujas ni arrugas. Pegue papel de limpieza de lentes de rayón al 100% a la superficie preparada.
Asegúrese de que sea plano y ligeramente tenso con cinta adhesiva en los cuatro lados del papel. Prepare la mezcla de silicona de dureza 0010 midiendo cinco mililitros de cada parte del kit de silicona en un recipiente desechable. Mezcle ligeramente los dos líquidos y agregue 1.5 mililitros de hexano.
Continúe mezclando hasta que la mezcla sea homogénea y esté bien mezclada. Use una pequeña escobilla para distribuir la mezcla de silicona sobre el papel de la lente y déjela reposar durante un minuto para asegurarse de que la silicona se haya empapado en el papel de la lente. De manera constante, raspe el exceso de silicona hacia un lado con la escobilla usando una pequeña cantidad de presión hacia abajo.
Realice una segunda pasada con la escobilla sin ejercer la presión hacia abajo para eliminar cualquier línea de silicona y producir una capa lisa. Solo para larvas, sumerja la parte superior de la cámara de alimentación en resina de fluoropolímero Fluon varias veces, lo que permite que se seque entre aplicaciones para producir una capa consistente. Deje que la membrana se cure durante al menos 24 horas en un ambiente libre de polvo, como un gabinete cerrado de productos químicos o de bioseguridad.
A continuación, mezcle partes iguales de la mezcla de silicona A y B para preparar la mezcla de silicona de 30 durezas para unir las cámaras a la membrana. Sumerja las cámaras de policarbonato aproximadamente un cuarto de pulgada en la mezcla de silicona y luego colóquelas en la lámina de membrana, teniendo cuidado de no superponerse a ninguna de las cintas. Deje que la silicona adherida se cure durante al menos 24 horas.
Usando un bisturí, corte cuidadosamente la membrana alrededor de cada una de las cámaras adjuntas, recortando los bordes para que pueda encajar suavemente en un pozo de la placa de seis pozos sin mucho raspado en los lados. Permita suficiente material fuera de la cámara para maximizar la adición de la membrana. Corte un pequeño trozo de la membrana sobrante de cada esquina y el centro de la lámina de membrana.
Retire la envoltura de plástico de cada pieza y mida las piezas con un micrómetro para determinar el grosor promedio de la membrana. Coloque las cámaras de alimentación junto con una junta tórica por cámara en un vaso de precipitados de vidrio para esterilizarlas en autoclave a 121 grados centígrados durante al menos 20 minutos para esterilizarlas. Deje que las cámaras se enfríen antes de usarlas.
Después de sacar las cámaras de membrana preparadas en autoclave y colocar la junta tórica alrededor de ellas, llene cada cámara con suficiente etanol al 70% para cubrir la membrana. Déjelo reposar en una placa de seis pocillos durante cinco minutos y luego busque cualquier fuga entre la cámara y la membrana y en la membrana misma. Vacíe el etanol de las cámaras y luego déjelo secar al aire dentro de un gabinete de bioseguridad o campana de flujo laminar.
Para calentar y activar el complemento en la sangre, caliéntelo a 56 grados centígrados durante 40 minutos y complemente la sangre bovina desfibrilada mecánicamente con dos gramos por litro de glucosa. Una vez que la membrana esté seca, aplique alrededor de 20 microlitros de fagostimulante en el interior de la cámara e incline la cámara para extenderla alrededor de la superficie. Cuando el fagostimulant esté seco, agregue rápidamente las garrapatas a la cámara con un cepillo o fórceps.
Selle la parte superior con parafilm ya que el calor del baño de agua puede hacer que se rasgue. Luego agregue cinco mililitros del calor y la sangre activada por pocillo o cámara en un tubo cónico y colóquelo en el baño de agua a 36 grados centígrados. Agregue cinco microlitros de ATP milimolar y 50 microlitros de 100X stock de fungizona de estreptomicina penicilina por cinco mililitros de sangre al tubo y transfiera 4.5 mililitros de sangre a un pocillo de una placa de seis pocillos.
Coloque suavemente la cámara en el pozo, ajustando la altura de la junta tórica en la cámara para que la membrana se asiente en la sangre, pero el nivel de sangre alrededor del lado no sobrepase el pozo. Luego coloque el pozo en la sangre en ángulo para evitar la formación de burbujas de aire entre la sangre y la membrana. Coloque la tapa de la placa de seis pocillos en la parte superior de las cámaras de alimentación.
Coloque la placa de seis pozos con cámaras en el baño de agua preparado a 34 grados centígrados y la tapa. Agregue cinco microlitros de tres milimolares ATP y 50 microlitros de 100X stock de penicilina estreptomicina fungizona por pocillo al tubo de sangre y transfiera 4.5 mililitros de sangre a un pocillo de una placa fresca de seis pocillos como se mostró anteriormente. Saque la placa de seis pozos con la cámara de garrapatas del baño de agua y retire la cámara del pozo.
Enjuague el exterior de la cámara y la membrana con 10 mililitros de PBS 1X esterilizado para eliminar la sangre. Con papel de filtro esterilizado en autoclave, seque suavemente la membrana y la cámara para eliminar el exceso de PBS. Si hay mucha condensación dentro de la cámara, seque los puntos húmedos con papel de filtro esterilizado en autoclave antes de sellarlo con parafilm nuevo.
Luego reemplace el parafilm en la parte superior de la cámara. Coloque la cámara de garrapatas en la nueva placa de seis pocillos con sangre fresca, ajustando la altura de la junta tórica si es necesario. Repita estos pasos para cada cámara de la placa.
Finalmente, coloque la tapa de la placa de seis pozos sobre la parte superior de las cámaras y mueva la nueva placa de seis pozos nuevamente al baño de agua de 34 grados centígrados. Aquí se muestra un alimento continuo con ninfas ixodes scapularis parcialmente hinchadas. Los puntos negros o marrones alrededor de los sitios de unión son la escarcha que se puede recolectar durante y después de la alimentación para hacer el fagostimulante.
Las ninfas ixodes scapularis parcialmente hinchadas se ven unidas a la membrana. Una cáscara del moho de larvas hinchadas también se puede ver aquí. Los números de congestión de garrapatas y los pesos de masa de huevos se presentan en esta tabla.
Las condiciones experimentales de congestión larvaria y ninfal tenían homogeneizado de órganos de ciervo agregado a la sangre, además de los suplementos utilizados en esta técnica. Aquí, la congestión exitosa se definió como garrapatas hinchadas que mudaban con éxito a la siguiente etapa en vivo o hembras hinchadas que ponían huevos con éxito. Se necesita práctica para obtener un grosor aceptable al aplicar silicona al papel de la lente, por lo que siempre es importante medir el grosor de la membrana antes de usarla.
La alimentación por membrana puede exponer a las garrapatas a patógenos o antibióticos. Los efectos de estos en aspectos de la biología de las garrapatas, como el éxito de la muda, la puesta de huevos y la supervivencia, se pueden evaluar después de la alimentación.
