חומרים גרעיניים, כגון פיגומי MAP, הם חומרים נקבוביים הניתנים להזרקה העשויים מחלקיקי הידרוג'ל בגודל מיקרו מקושרים. שליטה בשבר החלקיקים היא קריטית לתכונות החומר ולתגובות התאיות. שברי חלקיקים משתנים בפיגומי MAP יוצרים מגוון של תכונות פיגומים ותגובות תאים, אך טכניקה זו מאפשרת למשתמשים להגדיר את שבר החלקיקים הסופי בפיגומי MAP שהם יוצרים.
ניתן להשתמש בפיגומי MAP כדי לקדם תיקון והתחדשות של פצעים מורכבים, כמו גם כדי לספק תרופות. שבר חלקיקים, למשל, משפיע על קצב ומידת החדירה וההתחדשות של התאים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על פני כל הסוגים של הידרוג'לים גרעיניים.
כעת, כאשר אנו יכולים ליצור פיגומי MAP עם שברי חלקיקים הנשלטים על-ידי המשתמש, אנו יכולים לחקור מחדש את הפעילות הביולוגית של חומרים אלה ולחקור תגובות תאים ייחודיות, כגון כליאה. הגדרת דור המיקרוג'ל המיקרופלואידי דורשת זמן וסבלנות כשאתה לומד את הטכניקות. עדיף שיהיו מספר מכשירים מוכנים ומוכנים למקרה שתיתקל בבעיות בהתקנה.
התחל עם ייצור מיקרופלואידי של חומצה היאלורונית, או HA, ונורבורן, או NB, מיקרו-ג'לים. לפני ייבוש המיקרוג'לים, שקלו שפופרת עם מכסה הברגה בטוח לקריו. לאחר מכן, במכסה מנוע סטרילי, העבירו את המיקרוג'לים השטופים והמטוהרים לצינור מכסה הברגה בטוח לקריו באמצעות פיפטה תזוזה חיובית.
הוסיפו 70% אתנול למיקרוג'לים המטוהרים וערבבו היטב. צנטריפוגה את הצינור במשך חמש דקות ב 5, 000 גרם. שאפו את הסופר-נטנט, והוסיפו 70% אתנול.
מערבבים היטב ודוגרים למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, צנטריפוגה קצרה כדי להבטיח שהמיקרוג'לים נמצאים בתחתית הצינור. הוסיפו חנקן נוזלי למיכל קריוגני, והניחו את צינור המיקרוג'לים להקפאה מהירה.
לאחר 5 עד 10 דקות, להסיר את הצינור של microgels עם מלקחיים. הסר במהירות את הכובע, וכסה את הצינור ברקמה ברמת מעבדה. אבטחו את הרקמה בעזרת גומייה, והעבירו אותה למיכל ליופיליזציה, או לתא.
טען את הדגימה על הליופיליזר בהתאם להוראות היצרן, ועשה lyophilize ב 0.066 Torr ומינוס 63 מעלות צלזיוס. שקלו את המיקרו-ג'לים הליופיליים מהצינור לפני אחסונם בטמפרטורת החדר. מערבבים פולידימתילסילוקסן, או בסיס אלסטומר PDMS עם חומר הריפוי ביחס של 10 לאחד לפי מסה.
יוצקים את תערובת ה-PDMS לצלחת פטרי גדולה מפלסטיק ודגה במייבש למשך 30 דקות, או עד שכל הבועות נעלמות. לאחר שכל הבועות נעלמו, הכניסו בזהירות את התבנית שהודפסה בתלת-ממד לתוך ה-PDMS כדי למזער את היווצרותן של בועות חדשות. מכניסים לתנור ל-180 מעלות למשך שעתיים כדי לרפא את ה-PDMS.
לאחר הריפוי, השתמש בסכין, או סכין גילוח כדי לעקוב בעדינות סביב היקף התקן התרבית, ולהסיר בזהירות את התבנית. השתמש באגרוף ביופסיה של ארבעה מילימטרים כדי להסיר כל PDMS מתחתית הבארות. חתכו את המכשירים כך שיתאימו לכיסוי זכוכית.
השתמש בסרט כדי להסיר אבק מהצד התחתון של התקן התרבית. הניחו את כיסוי הזכוכית הנקי ואת מתקן התרבית על פלטה חמה בטמפרטורה של 135 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להסיר לחות. במכסה אדים, השתמש באקדח פלזמה קורונה גבוה על כיסוי הזכוכית ובצד התחתון של המכשיר למשך 30 שניות.
לאחר מכן חברו במהירות את המשטחים המטופלים יחד. הפעילו בעדינות לחץ כדי להבטיח אטימה טובה בין התקן התרבית לכיסוי הזכוכית. הכניסו את המכשיר לתנור של 60 מעלות למשך הלילה כדי לאבטח את הקשר.
למחרת, autoclave את המכשיר כדי לעקר לפני השימוש במבחנה. לאחר מכן, הכינו את חלקיק החישול המיקרו-נקבובי, או רכיבי פיגום MAP, בהתבסס על שבר החלקיקים הרצוי לתרבית תאים בפיגומי MAP. שקלו מיקרו-ג'לים ליופיליים כדי לקבוע את מסת המיקרו-ג'לים.
לאחר מכן שחזרו את המיקרו-ג'לים ב-84% מנפח ה-MAP הסופי של מדיית התאים בהתבסס על אחוז המשקל הנבחר MAP. תנו למיקרוג'לים להתנפח במשך 20 דקות. יש להמיס את החומצה ההיאלורונית, או HA-tetrazine, ואת מדיית התאים ב-16% מנפח ה-MAP הסופי.
לאחר שהתאים הגיעו למפגש הרצוי, הרימו וספרו את התאים. העבר 10, 000 תאים לכל מיקרוליטר MAP לצינור חדש. צנטריפוגה של התאים, ולשאוף את supernatant מן הכדור מבלי לשאוף את התאים.
הוסף מיקרוג'לים ומקשר צולב לכדור באמצעות פיפטה תזוזה. מערבבים היטב, וזורעים 10 מיקרוליטרים לבאר. פיפטה בתנועה מעגלית כדי לפזר באופן שווה את התערובת בבאר.
יש לאפשר למיקרוג'לים לשקוע בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות לפני הוספת מדיית תאים למילוי הבארות. שמרו על תרביות תלת-ממד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ושנו את המדיה לפי הצורך. כדי להימנע משאיפת הפיגום, ייצבו את קצה הפיפטה לאורך רכס הבאר העליונה.
בנקודות הזמן הרצויות, לתקן דגימות על ידי החלפת מדיה עם 50 microliters של 4% paraformaldehyde לכל באר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 50 microliters של PBS, או חיץ מועדף, ולהמשיך עבור immunofluorescence, או צביעה פלואורסצנטית באמצעות 50 microliters לכל גם את נפח העבודה. התקנים מיקרופלואידיים עם אזור ממוקד זרימה הוכחו כמייצרים מיקרו-ג'לים HA-NB בקוטר של 50 או 100 מיקרון.
המדיום לליופיליזציה של המיקרוג'לים עבר אופטימיזציה כדי למזער את היווצרות הקריוג'ל על ידי שימוש ב-70% אתנול. עם זאת, ניתן להשתמש במדיה אחרת, כגון אלכוהול איזופרופיל, מים ואצטוניטריל לסירוגין כדי להקל על היווצרות קריוגל. כדי להקל על קישור ביו-אורתוגונלי של מיקרו-ג'לים HA-NB, מסונתז מקשר צולב ליניארי מסוג HA-tetrazine.
ספקטרוסקופיית פרוטון NMR מראה שינוי מוצלח של 11% מיחידות החזרה של HA עם קבוצת תליון טטרזין. מוצר המיקרוג'ל המיובש שעבר ליאופיליזציה עבר התייבשות מחודשת בנפחים מיוחדים וחישול כדי להשיג פורמולציות שונות של מיקרוג'לים בפיגומים של MAP. אחוזי משקל אלה של מיקרו-ג'לים בפיגומי MAP התאימו לשברי חלקיקים ייחודיים.
תרבית תאים בפיגומי MAP מוצגת כאן. תאים בתרבית תלת-ממדית בפיגומי MAP תוקנו ביום החמישי, מוכתמים ומצולמים במיקרוסקופ קונפוקלי. פרוסות Z בודדות מראות הבדלים בגדילת התאים ובפיגומים הכוללים אחוזי משקל שונים MAP.
בחר את מדיית הליופיליזציה שלך בהתאם לשאלה אם אתה רוצה קריוגלים, או לא. אל תדלג על שלבי הדגירה, כך שלמיקרוג'לים שלך יהיה מספיק זמן להתנפח בתקשורת. ניתן להשתמש בטכניקות סטנדרטיות כגון מיקרוסקופיה, ציטומטריה של זרימה, ריצוף RNA ועוד כדי להעריך את תגובות התאים בתוך חומרים גרעיניים אלה עם נקבוביות מוגדרות.
