Materiais granulares, como andaimes MAP, são materiais injetáveis porosos feitos de partículas de hidrogel de tamanho micro interligadas. O controle da fração de partículas é fundamental para as propriedades do material e as respostas celulares. Frações de partículas variáveis em andaimes MAP resultam em uma variedade de propriedades de andaimes e respostas celulares, mas essa técnica permite que os usuários definam a fração de partícula final nos andaimes MAP que eles criam.
Os andaimes MAP podem ser usados para promover o reparo e a regeneração de feridas complexas, bem como para administrar medicamentos. A fração de partículas, por exemplo, afeta a taxa e o grau de infiltração e regeneração celular. Este método pode ser aplicado em todas as classes de hidrogéis granulares.
Agora que podemos fazer andaimes MAP com frações de partículas controladas pelo usuário, podemos estudar de forma reprodutível a bioatividade desses materiais e investigar respostas celulares únicas, como o confinamento. Configurar a geração de microgel microfluídico requer tempo e paciência enquanto você aprende as técnicas. É melhor ter vários dispositivos preparados e prontos para o caso de você ter problemas com a configuração.
Comece com a produção microfluídica de ácido hialurônico, ou HA, e Norborneno, ou NB, microgéis. Antes de secar os microgéis, pese um tubo de tampa de rosca crio-seguro. Em seguida, em um exaustor estéril, transfira os microgéis lavados e purificados para um tubo de tampa de rosca crio-seguro usando uma pipeta de deslocamento positivo.
Adicione etanol a 70% aos microgéis purificados e misture bem. Centrifugar o tubo durante cinco minutos a 5 000 g. Aspirar o sobrenadante e adicionar etanol a 70%.
Misture bem e incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, centrifugar brevemente para garantir que os microgéis estejam no fundo do tubo. Adicione nitrogênio líquido a um recipiente criogênico e coloque o tubo de microgéis para congelar rapidamente.
Após cinco a 10 minutos, remova o tubo de microgéis com pinça. Remova rapidamente a tampa e cubra o tubo com tecido de grau de laboratório. Prenda o tecido com um elástico e transfira-o para um recipiente de liofilização, ou câmara.
Carregue a amostra no liofilizador seguindo as instruções do fabricante e liofilize a 0,066 Torr e a 63 graus Celsius negativos. Pesar os microgéis liofilizados do tubo antes de armazená-los à temperatura ambiente. Misture o polidimetilsiloxano, ou base de elastômero PDMS com o agente de cura em uma proporção de 10 para um em massa.
Despeje a mistura PDMS em uma grande placa de Petri de plástico e degaseifique no exsicador por 30 minutos, ou até que todas as bolhas tenham desaparecido. Uma vez que todas as bolhas tenham desaparecido, coloque cuidadosamente o molde impresso em 3D no PDMS para minimizar a formação de novas bolhas. Coloque no forno a 60 graus Celsius por duas horas para curar o PDMS.
Após a cura, use uma faca ou lâmina de barbear para traçar suavemente ao redor do perímetro do dispositivo de cultura e remova cuidadosamente o molde. Use um soco de biópsia de quatro milímetros para remover qualquer PDMS do fundo dos poços. Corte os dispositivos para caber em uma folha de tampa de vidro.
Use fita adesiva para remover a poeira do lado inferior do dispositivo de cultura. Coloque o deslizamento de tampa de vidro limpo e o dispositivo de cultura em uma placa quente a 135 graus Celsius por 15 minutos para remover a umidade. Em um exaustor, use uma pistola de plasma corona no alto da tampa de vidro e no lado inferior do dispositivo por 30 segundos.
Em seguida, ligue rapidamente as superfícies tratadas. Aplique pressão suavemente para garantir uma boa vedação entre o dispositivo de cultura e o deslizamento da tampa de vidro. Coloque o dispositivo em um forno de 60 graus Celsius durante a noite para fixar a ligação.
No dia seguinte, autoclave o dispositivo para esterilizar antes de usar in vitro. Em seguida, prepare a Partícula Microporosa Recozida, ou componentes do andaime MAP, com base na fração de partículas desejada para cultura celular em andaimes MAP. Pesar microgéis liofilizados para determinar a massa de microgéis.
Em seguida, reconstitua os microgéis em 84% do volume MAP final do meio celular com base no MAP percentual de peso escolhido. Deixe os microgéis incharem por 20 minutos. Dissolva o ácido hialurônico, ou HA-tetrazina, e o meio celular em 16% do volume MAP final.
Uma vez que as células tenham atingido a confluência desejada, levante e conte as células. Transfira 10.000 células por microlitro MAP para um novo tubo. Centrifugar as células e aspirar o sobrenadante do pellet sem aspirar as células.
Adicione microgéis e reticulante ao pellet usando uma pipeta de deslocamento. Misture bem e semeie 10 microlitros por poço. Pipeta em movimento circular para distribuir uniformemente a mistura no poço.
Deixe os microgéis recozidos a 37 graus Celsius por 25 minutos antes de adicionar meios celulares para encher os poços. Mantenha as culturas 3D a 37 graus Celsius e altere a mídia conforme necessário. Para evitar aspirar o andaime, estabilize a ponta da pipeta ao longo da crista do poço superior.
Nos momentos desejados, fixe as amostras substituindo o meio por 50 microlitros de paraformaldeído a 4% por poço por 30 minutos à temperatura ambiente. Lave as amostras três vezes com 50 microlitros de PBS, ou tampão preferido, e prossiga para imunofluorescência ou coloração por fluorescência usando 50 microlitros por bem como o volume de trabalho. Dispositivos microfluídicos com uma região de foco de fluxo mostraram produzir microgéis HA-NB de 50 ou 100 mícrons de diâmetro.
O meio de liofilização dos microgéis foi otimizado para minimizar a formação de criogel utilizando etanol a 70%. No entanto, outros meios, como álcool isopropílico, água e acetonitrila, podem ser usados de forma intercambiável para facilitar a formação de criogel. Para facilitar a interligação bio-ortogonal de microgéis HA-NB foi sintetizado um reticulante linear HA-tetrazina.
A espectroscopia de RMN de prótons mostra uma modificação bem-sucedida de 11% das unidades de repetição de AH com um grupo pingente de tetrazina. O produto de microgel liofilizado seco foi reidratado com volumes especiais e recozido para obter diferentes formulações de porcentagem de peso de microgéis em andaimes MAP. Essas porcentagens ponderais de microgéis em andaimes MAP corresponderam a frações de partículas únicas.
A cultura de células em andaimes MAP é mostrada aqui. As células em cultura 3D em andaimes MAP foram fixadas no quinto dia, coradas e fotografadas em microscópio confocal. Fatias Z únicas mostram diferenças no crescimento celular e andaimes compreendendo diferentes porcentagens de peso MAP.
Selecione sua mídia de liofilização apropriadamente, dependendo se você deseja criogéis ou não. Não pule as etapas de incubação, para que seus microgéis tenham tempo suficiente para inchar no meio. Técnicas padrão, como microscopia, citometria de fluxo, sequenciamento de RNA e muito mais, podem ser usadas para avaliar as respostas celulares dentro desses materiais granulares com porosidades definidas.
