Los materiales granulares, como los andamios MAP, son materiales inyectables porosos hechos de partículas de hidrogel de tamaño micro interconectadas. El control de la fracción de partículas es fundamental para las propiedades del material y las respuestas celulares. Las fracciones de partículas variables en andamios MAP dan como resultado un rango de propiedades de andamio y respuestas celulares, pero esta técnica permite a los usuarios definir la fracción de partículas final en los andamios MAP que crean.
Los andamios MAP se pueden utilizar para promover la reparación y regeneración de heridas complejas, así como para administrar medicamentos. La fracción de partículas, por ejemplo, afecta la velocidad y el grado de infiltración y regeneración celular. Este método se puede aplicar en todas las clases de hidrogeles granulares.
Ahora que podemos hacer andamios MAP con fracciones de partículas controladas por el usuario, podemos estudiar de manera reproducible la bioactividad de estos materiales e investigar respuestas celulares únicas, como el confinamiento. Configurar la generación de microgel microfluídico requiere tiempo y paciencia a medida que aprende las técnicas. Es mejor tener varios dispositivos preparados y listos en caso de que tenga problemas con la configuración.
Comience con la producción microfluídica de ácido hialurónico, o HA, y norborneno, o NB, microgeles. Antes de secar los microgeles, pese un tubo de tapón de rosca crioseguro. Luego, en una campana estéril, transfiera los microgeles lavados y purificados a un tubo de tapón de rosca crioseguro utilizando una pipeta de desplazamiento positivo.
Agregue 70% de etanol a los microgeles purificados y mezcle bien. Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 5, 000 g. Aspire el sobrenadante y agregue etanol al 70%.
Mezclar bien e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, centrifuga brevemente para asegurarte de que los microgeles estén en el fondo del tubo. Agregue nitrógeno líquido a un recipiente criogénico y coloque el tubo de microgeles para congelar rápidamente.
Después de cinco a 10 minutos, retire el tubo de microgeles con fórceps. Retire rápidamente la tapa y cubra el tubo con tejido de laboratorio. Asegure el tejido con una banda elástica y transfiéralo a un recipiente o cámara de liofilización.
Cargue la muestra en el liofilizador siguiendo las instrucciones del fabricante y liofilice a 0.066 Torr y menos 63 grados centígrados. Pese los microgeles liofilizados del tubo antes de almacenarlos a temperatura ambiente. Mezcle la base de elastómero de polidimetilsiloxano o PDMS con el agente de curado en una proporción de 10 a uno en masa.
Vierta la mezcla de PDMS en una placa de Petri de plástico grande y desgasifique en el desecador durante 30 minutos, o hasta que todas las burbujas hayan desaparecido. Una vez que todas las burbujas hayan desaparecido, coloque cuidadosamente el molde impreso en 3D en el PDMS para minimizar la formación de nuevas burbujas. Colocar en el horno a 60 grados centígrados durante dos horas para curar el PDMS.
Después del curado, use un cuchillo o una cuchilla de afeitar para trazar suavemente alrededor del perímetro del dispositivo de cultivo y retire cuidadosamente el moho. Use un punzón de biopsia de cuatro milímetros para extraer cualquier PDMS del fondo de los pocillos. Corte los dispositivos para que quepan en un cubreobjetos de vidrio.
Use cinta adhesiva para eliminar el polvo de la parte inferior del dispositivo de cultivo. Coloque el dispositivo de cultivo y deslizamiento de cubierta de vidrio limpio en una placa caliente a 135 grados centígrados durante 15 minutos para eliminar la humedad. En una campana extractora, use una pistola de plasma corona en lo alto del resbalón de la cubierta de vidrio y en la parte inferior del dispositivo durante 30 segundos.
Luego, une rápidamente las superficies tratadas. Aplique presión suavemente para asegurar un buen sellado entre el dispositivo de cultivo y el deslizamiento de la cubierta de vidrio. Coloque el dispositivo en un horno de 60 grados centígrados durante la noche para asegurar la unión.
Al día siguiente, autoclave el dispositivo a esterilizar antes de usarlo in vitro. A continuación, prepare la partícula recocida microporosa, o componentes de andamio MAP, en función de la fracción de partículas deseada para el cultivo celular en andamios MAP. Pesar microgeles liofilizados para determinar la masa de microgeles.
Luego reconstituir los microgeles en el 84% del volumen final de MAP de los medios celulares en función del porcentaje de MAP elegido en peso. Deje que los microgeles se hinchen durante 20 minutos. Disuelva el ácido hialurónico, o HA-tetrazina, y los medios celulares en el 16% del volumen final de MAP.
Una vez que las células hayan alcanzado la confluencia deseada, levante y cuente las células. Transfiera 10, 000 células por microlitro MAP a un nuevo tubo. Centrifugar las células y aspirar el sobrenadante del pellet sin aspirar las células.
Añadir microgeles y reticulante al pellet mediante una pipeta de desplazamiento. Mezclar bien, y sembrar 10 microlitros por pocillo. Pipetear con movimientos circulares para distribuir uniformemente la mezcla en el pozo.
Deje que los microgeles se reanuden a 37 grados centígrados durante 25 minutos antes de agregar medios celulares para llenar los pocillos. Mantenga las culturas 3D a 37 grados centígrados y cambie los medios según sea necesario. Para evitar aspirar el andamio, estabilice la punta de la pipeta a lo largo de la cresta del pocillo superior.
En los puntos de tiempo deseados, fije las muestras reemplazando los medios con 50 microlitros de paraformaldehído al 4% por pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave las muestras tres veces con 50 microlitros de PBS, o tampón preferido, y proceda a la inmunofluorescencia o tinción de fluorescencia utilizando 50 microlitros por pozo como el volumen de trabajo. Se demostró que los dispositivos microfluídicos con una región de enfoque de flujo producen microgeles HA-NB de 50 o 100 micras de diámetro.
El medio para liofilizar los microgeles se optimizó para minimizar la formación de criogel mediante el uso de etanol al 70%. Sin embargo, otros medios, como el alcohol isopropílico, el agua y el acetonitrilo se pueden usar indistintamente para facilitar la formación de criogel. Para facilitar la interconexión bioortogonal de los microgeles HA-NB se sintetizó un reticulante lineal de HA-tetrazina.
La espectroscopia de RMN de protones muestra una modificación exitosa del 11% de las unidades de repetición de HA con un grupo colgante de tetrazina. El producto de microgel liofilizado seco se rehidrató con volúmenes especiales y se recoció para lograr diferentes formulaciones de porcentaje en peso de microgeles en andamios MAP. Estos porcentajes de peso de microgeles en andamios MAP correspondían a fracciones de partículas únicas.
Aquí se muestra el cultivo celular en andamios MAP. Las células en cultivo 3D en andamios MAP se fijaron el quinto día, se tiñeron y se obtuvieron imágenes en un microscopio confocal. Los cortes Z individuales muestran diferencias en el crecimiento celular y los andamios que comprenden diferentes porcentajes de MAP en peso.
Seleccione sus medios de liofilización adecuadamente dependiendo de si desea criogels, o no. No se salte los pasos de incubación, para que sus microgeles tengan tiempo suficiente para hincharse en los medios. Se pueden usar técnicas estándar como microscopía, citometría de flujo, secuenciación de ARN y más para evaluar las respuestas celulares dentro de estos materiales granulares con porosidades definidas.
