Les matériaux granulaires, tels que les échafaudages MAP, sont des matériaux injectables poreux fabriqués à partir de particules d’hydrogel de taille microscopique interconnectées. Le contrôle de la fraction des particules est essentiel aux propriétés des matériaux et aux réponses cellulaires. Les fractions de particules variables dans les échafaudages MAP entraînent une gamme de propriétés d’échafaudage et de réponses cellulaires, mais cette technique permet aux utilisateurs de définir la fraction de particules finale dans les échafaudages MAP qu’ils créent.
Les échafaudages MAP peuvent être utilisés pour favoriser la réparation et la régénération de plaies complexes, ainsi que pour administrer des médicaments. La fraction particulaire, par exemple, affecte le taux et le degré d’infiltration et de régénération cellulaires. Cette méthode peut être appliquée à toutes les classes d’hydrogels granulaires.
Maintenant que nous pouvons fabriquer des échafaudages MAP avec des fractions de particules contrôlées par l’utilisateur, nous pouvons étudier de manière reproductible la bioactivité de ces matériaux et étudier des réponses cellulaires uniques, telles que le confinement. La mise en place de la génération de microgel microfluidique nécessite du temps et de la patience pour apprendre les techniques. Il est préférable d’avoir plusieurs appareils préparés et prêts au cas où vous rencontreriez des problèmes avec la configuration.
Commencez par la production microfluidique d’acide hyaluronique, ou HA, et de microgels de norbornène, ou NB. Avant de sécher les microgels, pesez un tube à vis cryo-sûr. Ensuite, dans une hotte stérile, transférer les microgels lavés et purifiés dans un tube à vis cryo-sécuritaire à l’aide d’une pipette volumétrique.
Ajouter 70% d’éthanol aux microgels purifiés et bien mélanger. Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 5 000 g. Aspirer le surnageant et ajouter 70% d’éthanol.
Bien mélanger et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, centrifuger brièvement pour s’assurer que les microgels sont au fond du tube. Ajouter de l’azote liquide dans un récipient cryogénique et placer le tube de microgels pour qu’il soit congelé.
Après cinq à 10 minutes, retirez le tube de microgels avec une pince. Retirez rapidement le capuchon et couvrez le tube avec un mouchoir en papier de qualité laboratoire. Fixez le tissu avec un élastique et transférez-le dans un récipient ou une chambre de lyophilisation.
Chargez l’échantillon sur le lyophilisateur en suivant les instructions du fabricant et lyophilisez à 0,066 Torr et moins 63 degrés Celsius. Pesez les microgels lyophilisés du tube avant de les conserver à température ambiante. Mélanger le polydiméthylsiloxane, ou base élastomère PDMS avec l’agent de durcissement à un rapport de 10 à un en masse.
Verser le mélange PDMS dans une grande boîte de Petri en plastique et dégazer dans le dessiccateur pendant 30 minutes, ou jusqu’à ce que toutes les bulles aient disparu. Une fois que toutes les bulles ont disparu, placez soigneusement le moule imprimé en 3D dans le PDMS pour minimiser la formation de nouvelles bulles. Placer au four à 60 degrés Celsius pendant deux heures pour durcir le PDMS.
Après le durcissement, utilisez un couteau ou une lame de rasoir pour tracer doucement autour du périmètre du dispositif de culture et retirez soigneusement la moisissure. Utilisez un poinçon de biopsie de quatre millimètres pour retirer tout PDMS du fond des puits. Coupez les appareils pour qu’ils s’adaptent sur un couvercle en verre.
Utilisez du ruban adhésif pour enlever la poussière de la face inférieure du dispositif de culture. Placez le couvercle en verre propre et le dispositif de culture sur une plaque chauffante à 135 degrés Celsius pendant 15 minutes pour éliminer l’humidité. Dans une hotte, utilisez un pistolet à plasma corona haut sur le couvercle en verre et le côté inférieur de l’appareil pendant 30 secondes.
Ensuite, liez rapidement les surfaces traitées ensemble. Appliquez doucement une pression pour assurer une bonne étanchéité entre le dispositif de culture et le couvercle en verre. Placez l’appareil dans un four à 60 degrés Celsius pendant la nuit pour sécuriser le lien.
Le lendemain, autoclaver l’appareil à stériliser avant utilisation in vitro. Ensuite, préparez les composants de l’échafaudage microporeux recuit, ou MAP, en fonction de la fraction de particules souhaitée pour la culture cellulaire dans des échafaudages MAP. Peser les microgels lyophilisés pour déterminer la masse des microgels.
Reconstituez ensuite les microgels dans 84% du volume MAP final du milieu cellulaire en fonction du pourcentage de poids MAP choisi. Laissez les microgels gonfler pendant 20 minutes. Dissoudre l’acide hyaluronique, ou HA-tétrazine, et le milieu cellulaire dans 16% du volume final de MAP.
Une fois que les cellules ont atteint la confluence désirée, soulevez et comptez les cellules. Transférer 10 000 cellules par microlitre de MAP dans un nouveau tube. Centrifuger les cellules et aspirer le surnageant de la pastille sans aspirer les cellules.
Ajouter les microgels et les agents de réticulation à la pastille à l’aide d’une pipette à déplacement. Bien mélanger et ensemencer 10 microlitres par puits. Pipeter dans un mouvement circulaire pour répartir uniformément le mélange dans le puits.
Laisser les microgels recuit à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes avant d’ajouter des milieux cellulaires pour remplir les puits. Maintenez les cultures 3D à 37 degrés Celsius et changez de support si nécessaire. Pour éviter d’aspirer l’échafaudage, stabilisez la pointe de la pipette le long de la crête du puits supérieur.
Aux points temporels souhaités, fixer les échantillons en remplaçant le média par 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % par puits pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez les échantillons trois fois avec 50 microlitres de PBS, ou tampon préféré, et procédez à l’immunofluorescence, ou coloration par fluorescence en utilisant 50 microlitres par puits ainsi que le volume de travail. Il a été démontré que les dispositifs microfluidiques avec une région de focalisation d’écoulement produisaient des microgels HA-NB de 50 ou 100 microns de diamètre.
Le milieu de lyophilisation des microgels a été optimisé pour minimiser la formation de cryogel en utilisant de l’éthanol à 70%. Cependant, d’autres milieux, tels que l’alcool isopropylique, l’eau et l’acétonitrile, peuvent être utilisés de manière interchangeable pour faciliter la formation de cryogel. Pour faciliter l’interconnexion bio-orthogonale des microgels HA-NB, un agent de réticulation linéaire HA-tétrazine a été synthétisé.
La spectroscopie RMN du proton montre une modification réussie de 11% des unités de répétition HA avec un groupe pendentif tétrazine. Le produit de microgel lyophilisé séché a été réhydraté avec des volumes spéciaux et recuit pour obtenir différents pourcentages de poids de microgels dans des échafaudages MAP. Ces pourcentages pondéraux de microgels dans les échafaudages MAP correspondaient à des fractions de particules uniques.
La culture cellulaire dans des échafaudages MAP est illustrée ici. Les cellules en culture 3D dans des échafaudages MAP ont été fixées le cinquième jour, colorées et imagées sur un microscope confocal. Les coupes Z uniques montrent des différences dans la croissance cellulaire et les échafaudages comprenant différents pourcentages de poids MAP.
Sélectionnez vos milieux de lyophilisation de manière appropriée selon que vous voulez des cryogels, ou non. Ne sautez pas les étapes d’incubation, afin que vos microgels aient suffisamment de temps pour gonfler dans le média. Des techniques standard telles que la microscopie, la cytométrie en flux, le séquençage de l’ARN, etc. peuvent être utilisées pour évaluer les réponses cellulaires dans ces matériaux granulaires avec des porosités définies.
