MAP 스캐폴드와 같은 입상 물질은 상호 연결된 마이크로 크기의 하이드로겔 입자로 만들어진 다공성 주사 가능한 재료입니다. 입자 분획을 제어하는 것은 재료 특성과 세포 반응에 매우 중요합니다. MAP 스캐폴드의 가변 입자 분획은 다양한 스캐폴드 특성과 세포 반응을 초래하지만, 이 기술을 통해 사용자는 자신이 만든 MAP 스캐폴드에서 최종 입자 분획을 정의할 수 있습니다.
MAP 스캐폴드는 복잡한 상처의 복구 및 재생을 촉진하고 약물을 전달하는 데 사용할 수 있습니다. 입자 분획은, 예를 들어, 세포 침윤 및 재생의 속도 및 정도에 영향을 미친다. 이 방법은 모든 종류의 과립 하이드로겔에 적용할 수 있습니다.
이제 사용자가 제어하는 입자 분획으로 MAP 스캐폴드를 만들 수 있으므로 이러한 물질의 생체 활성을 재현성 있게 연구하고 감금과 같은 고유한 세포 반응을 조사할 수 있습니다. 미세유체 마이크로겔 생성을 설정하려면 기술을 배울 때 시간과 인내가 필요합니다. 설정에 문제가 발생할 경우를 대비하여 여러 장치를 준비하고 준비하는 것이 가장 좋습니다.
히알루론산 또는 HA 및 노르보르넨 또는 NB 마이크로젤의 미세유체 생산으로 시작하십시오. 마이크로젤을 건조하기 전에 극저온 안전 스크류 캡 튜브의 무게를 잰다. 그런 다음 멸균 후드에서 세척 및 정제된 마이크로젤을 정변위 피펫을 사용하여 극저온 안전 스크류 캡 튜브로 옮깁니다.
정제 된 마이크로 젤에 70 % 에탄올을 첨가하고 잘 섞는다. 튜브를 5, 000 g에서 5 분간 원심 분리하십시오. 상청액을 흡인하고 70 % 에탄올을 첨가하십시오.
잘 섞고 섭씨 4도에서 밤새 배양하십시오. 다음날, 마이크로젤이 튜브 바닥에 있는지 확인하기 위해 간단히 원심분리합니다. 극저온 용기에 액체 질소를 넣고 마이크로젤 튜브를 급속 동결에 놓습니다.
5 분에서 10 분 후에 집게로 마이크로 젤 튜브를 제거하십시오. 캡을 빠르게 제거하고 실험실 등급 티슈로 튜브를 덮습니다. 고무 밴드로 조직을 고정하고 동결 건조 용기 또는 챔버로 옮깁니다.
제조업체의 지침에 따라 동결 건조기에 샘플을 넣고 0.066 Torr 및 섭씨 영하 63도에서 동결 건조합니다. 동결건조된 마이크로젤을 실온에서 보관하기 전에 튜브에서 칭량합니다. 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 엘라스토머 베이스를 경화제와 10:1질량비로 혼합한다.
PDMS 혼합물을 큰 플라스틱 페트리 접시에 붓고 데시케이터에서 30분 동안 또는 모든 기포가 사라질 때까지 가스를 제거합니다. 모든 기포가 사라지면 3D 인쇄 금형을 PDMS에 조심스럽게 배치하여 새로운 기포 형성을 최소화합니다. PDMS를 경화시키기 위해 섭씨 60도의 오븐에 2시간 동안 두십시오.
경화 후 칼이나 면도날을 사용하여 배양 장치의 둘레를 부드럽게 추적하고 곰팡이를 조심스럽게 제거하십시오. 4mm 생검 펀치를 사용하여 웰 바닥에서 PDMS를 제거하십시오. 유리 커버 슬립에 맞게 장치를 자릅니다.
테이프를 사용하여 배양 장치의 바닥면에서 먼지를 제거하십시오. 깨끗한 유리 커버 슬립과 배양 장치를 섭씨 135도의 핫플레이트에 15분 동안 놓아 수분을 제거합니다. 흄 후드에서 유리 커버 슬립과 장치 바닥면에 코로나 플라즈마 건을 30초 동안 사용합니다.
그런 다음 처리 된 표면을 빠르게 결합하십시오. 배양 장치와 유리 커버 슬립 사이에 양호한 밀봉을 보장하기 위해 부드럽게 압력을 가하십시오. 장치를 섭씨 60도 오븐에 밤새 넣어 접착력을 고정합니다.
다음날, 시험관 내에서 사용하기 전에 멸균하기 위해 장치를 오토 클레이브하십시오. 다음으로, MAP 스캐폴드에서 세포 배양을 위해 원하는 입자 분획을 기반으로 미세다공성 어닐링 입자 또는 MAP 스캐폴드 성분을 준비합니다. 동결건조된 마이크로젤의 무게를 측정하여 마이크로젤의 질량을 측정합니다.
그런 다음 선택한 중량% MAP를 기준으로 세포 배지의 최종 MAP 부피의 84%에서 마이크로겔을 재구성합니다. 마이크로젤이 20분 동안 부풀어 오르도록 합니다. 히알루론산 또는 HA-테트라진과 세포 배지를 최종 MAP 부피의 16%에 녹입니다.
세포가 원하는 컨플루언스에 도달하면 세포를 들어 올리고 계산합니다. 마이크로 리터 MAP 당 10, 000 개의 세포를 새 튜브로 옮깁니다. 세포를 원심분리하고, 세포를 흡인하지 않고 펠릿으로부터 상청액을 흡인한다.
마이크로젤과 가교제를 치환 피펫을 사용하여 펠릿에 추가합니다. 잘 섞고 우물 당 10 마이크로 리터를 씨를 뿌린다. 혼합물을 우물에 고르게 분배하기 위해 원형 운동으로 피펫.
마이크로젤을 섭씨 37도에서 25분 동안 어닐링한 후 웰을 채우기 위해 세포 배지를 추가합니다. 3D 배양을 섭씨 37도로 유지하고 필요에 따라 배지를 변경합니다. 비계를 흡인하지 않으려면 상부 우물의 융기 부분을 따라 피펫 팁을 안정화하십시오.
원하는 시점에 실온에서 30분 동안 웰당 50마이크로리터의 4% 파라포름알데히드로 배지를 교체하여 샘플을 고정합니다. 샘플을 50 마이크로리터의 PBS, 또는 바람직한 완충액으로 3회 세척하고, 작업 부피 웰당 50 마이크로리터를 사용하여 면역형광 또는 형광 염색을 진행한다. 유동 초점 영역을 갖는 미세유체 장치는 직경이 50 또는 100 미크론인 HA-NB 마이크로겔을 생성하는 것으로 나타났다.
마이크로겔을 동결건조하기 위한 배지는 70%에탄올을 사용하여 크라이오겔 형성을 최소화하도록 최적화되었습니다. 그러나 이소프로필 알코올, 물 및 아세토니트릴과 같은 다른 매체는 크라이오겔 형성을 촉진하기 위해 상호 교환적으로 사용할 수 있습니다. HA-NB 마이크로겔의 생체직교 상호결합을 용이하게 하기 위해 선형 HA-테트라진 가교결합제를 합성하였다.
양성자 NMR 분광법은 테트라 진 펜던트 그룹을 사용하여 HA 반복 단위의 11 %를 성공적으로 변형 한 것을 보여줍니다. 건조된 동결건조된 마이크로겔 생성물을 특별한 부피로 재수화시키고, 어닐링하여 MAP 스캐폴드에서 마이크로겔의 상이한 중량% 제형을 달성하였다. MAP 스캐폴드에서 마이크로겔의 이러한 중량 백분율은 고유한 입자 분획에 해당합니다.
MAP 스캐폴드에서의 세포 배양이 여기에 표시됩니다. MAP 스캐폴드에서 3D 배양된 세포를 5일째에 고정하고 염색하고 컨포칼 현미경으로 이미지화했습니다. 단일 Z-슬라이스는 상이한 중량% MAP를 포함하는 스캐폴드 및 세포 성장의 차이를 나타낸다.
크라이오겔을 원하는지 여부에 따라 동결건조 매체를 적절하게 선택하십시오. 마이크로젤이 배지에서 팽창할 수 있는 충분한 시간을 갖도록 배양 단계를 건너뛰지 마십시오. 현미경, 유세포분석, RNA 시퀀싱 등과 같은 표준 기술을 사용하여 정의된 다공성을 가진 이러한 과립 물질 내에서 세포 반응을 평가할 수 있습니다.
