I materiali granulari, come gli scaffold MAP, sono materiali iniettabili porosi costituiti da particelle di idrogel di dimensioni micro interconnesse. Il controllo della frazione di particelle è fondamentale per le proprietà dei materiali e le risposte cellulari. Le frazioni di particelle variabili negli scaffold MAP determinano una serie di proprietà dello scaffold e risposte delle celle, ma questa tecnica consente agli utenti di definire la frazione finale di particelle negli scaffold MAP che creano.
Gli scaffold MAP possono essere utilizzati per promuovere la riparazione e la rigenerazione di ferite complesse, nonché per somministrare farmaci. La frazione di particelle, ad esempio, influenza la velocità e il grado di infiltrazione e rigenerazione cellulare. Questo metodo può essere applicato a tutte le classi di idrogel granulari.
Ora che possiamo realizzare scaffold MAP con frazioni di particelle controllate dall'utente, possiamo studiare in modo riproducibile la bioattività di questi materiali e studiare risposte cellulari uniche, come il confinamento. L'impostazione della generazione di microgel microfluidici richiede tempo e pazienza mentre si imparano le tecniche. È meglio avere più dispositivi preparati e pronti nel caso in cui si verifichino problemi con la configurazione.
Inizia con la produzione microfluidica di acido ialuronico, o HA, e Norbornene, o NB, microgel. Prima di asciugare i microgel, pesare un tubo con tappo a vite crio-sicuro. Quindi, in una cappa sterile, trasferire i microgel lavati e purificati in un tubo con tappo a vite criogenico utilizzando una pipetta a spostamento positivo.
Aggiungere il 70% di etanolo ai microgel purificati e mescolare bene. Centrifugare il tubo per cinque minuti a 5.000 g. Aspirare il surnatante e aggiungere il 70% di etanolo.
Mescolare bene e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, centrifugare brevemente per assicurarsi che i microgel siano sul fondo del tubo. Aggiungere azoto liquido a un contenitore criogenico e posizionare il tubo di microgel per congelare il flash.
Dopo cinque o 10 minuti, rimuovere il tubo di microgel con una pinza. Rimuovere rapidamente il cappuccio e coprire il tubo con tessuto di laboratorio. Fissare il tessuto con un elastico e trasferirlo in un contenitore di liofilizzazione o in una camera.
Caricare il campione sul liofilizzatore seguendo le istruzioni del produttore e liofilizzare a 0,066 Torr e meno 63 gradi Celsius. Pesare i microgel liofilizzati dal tubo prima di conservarli a temperatura ambiente. Mescolare polidimetilsilossano o base di elastomero PDMS con l'agente di polimerizzazione con un rapporto di 10 a uno in massa.
Versare la miscela PDMS in una grande capsula di Petri di plastica e degassare nell'essiccatore per 30 minuti, o fino a quando tutte le bolle sono scomparse. Una volta che tutte le bolle sono scomparse, posizionare con attenzione lo stampo stampato in 3D nel PDMS per ridurre al minimo la formazione di nuove bolle. Mettere in forno a 60 gradi Celsius per due ore per polimerizzare il PDMS.
Dopo la polimerizzazione, utilizzare un coltello o una lama di rasoio per tracciare delicatamente il perimetro del dispositivo di coltura e rimuovere con cura lo stampo. Utilizzare un pugno bioptico di quattro millimetri per rimuovere qualsiasi PDMS dal fondo dei pozzetti. Tagliare i dispositivi per adattarli a una vetrina.
Utilizzare del nastro adesivo per rimuovere la polvere dal lato inferiore del dispositivo di coltura. Posizionare il vetrino di copertura in vetro pulito e il dispositivo di coltura su una piastra calda a 135 gradi Celsius per 15 minuti per rimuovere l'umidità. In una cappa aspirante, utilizzare una pistola al plasma corona in alto sul vetrino di copertura e sul lato inferiore del dispositivo per 30 secondi.
Quindi incollare rapidamente le superfici trattate. Applicare delicatamente una pressione per garantire una buona tenuta tra il dispositivo di coltura e la slitta di copertura in vetro. Posizionare il dispositivo in un forno a 60 gradi Celsius durante la notte per fissare il legame.
Il giorno seguente, autoclavare il dispositivo per sterilizzare prima dell'uso in vitro. Quindi, preparare la particella ricotto microporosa, o componenti dello scaffold MAP, in base alla frazione di particelle desiderata per la coltura cellulare negli scaffold MAP. Pesare microgel liofilizzati per determinare la massa dei microgel.
Quindi ricostituire i microgel nell'84% del volume MAP finale dei mezzi cellulari in base alla percentuale di peso MAP scelta. Lasciare gonfiare i microgel per 20 minuti. Sciogliere l'acido ialuronico, o HA-tetrazina, e i supporti cellulari nel 16% del volume finale di MAP.
Una volta che le cellule hanno raggiunto la confluenza desiderata, sollevare e contare le cellule. Trasferire 10.000 cellule per microlitro MAP in un nuovo tubo. Centrifugare le cellule e aspirare il surnatante dal pellet senza aspirare le cellule.
Aggiungere microgel e reticolante al pellet utilizzando una pipetta di spostamento. Mescolare bene e seminare 10 microlitri per pozzetto. Pipettare con un movimento circolare per distribuire uniformemente la miscela nel pozzetto.
Lasciare ricottura dei microgel a 37 gradi Celsius per 25 minuti prima di aggiungere mezzi cellulari per riempire i pozzetti. Mantenere le culture 3D a 37 gradi Celsius e modificare i supporti in base alle esigenze. Per evitare di aspirare l'impalcatura, stabilizzare la punta della pipetta lungo la cresta del pozzetto superiore.
Nei punti temporali desiderati, fissare i campioni sostituendo il mezzo con 50 microlitri di paraformaldeide al 4% per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare i campioni tre volte con 50 microlitri di PBS, o tampone preferito, e procedere per l'immunofluorescenza o la colorazione a fluorescenza utilizzando 50 microlitri per pozzetto del volume di lavoro. È stato dimostrato che i dispositivi microfluidici con una regione di focalizzazione del flusso producono microgel HA-NB di 50 o 100 micron di diametro.
Il mezzo per la liofilizzazione dei microgel è stato ottimizzato per ridurre al minimo la formazione di criogel utilizzando il 70% di etanolo. Tuttavia, altri mezzi, come l'alcol isopropilico, l'acqua e l'acetonitrile possono essere utilizzati in modo intercambiabile per facilitare la formazione di criogel. Per facilitare l'interconnessione bio-ortogonale dei microgel HA-NB è stato sintetizzato un cross-linker lineare HA-tetrazina.
La spettroscopia NMR protonica mostra una modifica riuscita dell'11% delle unità ripetute HA con un gruppo pendente tetrazina. Il prodotto microgel liofilizzato essiccato è stato reidratato con volumi speciali e ricotto per ottenere diverse formulazioni percentuali di peso di microgel in scaffold MAP. Queste percentuali di peso di microgel negli scaffold MAP corrispondevano a frazioni di particelle uniche.
La coltura cellulare negli scaffold MAP è mostrata qui. Le cellule in coltura 3D negli scaffold MAP sono state fissate il quinto giorno, colorate e visualizzate su un microscopio confocale. Le singole fette Z mostrano differenze nella crescita cellulare e scaffold che comprendono diversi MAP percentuali di peso.
Selezionare il terreno di liofilizzazione in modo appropriato a seconda che si desideri criogel o meno. Non saltare le fasi di incubazione, in modo che i microgel abbiano tempo sufficiente per gonfiarsi nei media. Tecniche standard come microscopia, citometria a flusso, sequenziamento dell'RNA e altro possono essere utilizzate per valutare le risposte cellulari all'interno di questi materiali granulari con porosità definite.
